Summary
يوصف أسلوب نقل الجينات في مخ الفأر النامية باستخدام أسلوب فريد الجراحية وشكل خاص من الأقطاب الكهربائية. هذا الأسلوب الفريد يسمح ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد الزمان والمكان ، والتي ستساعد الكثير من علماء الأعصاب في دراسة تطور الدماغ.
Abstract
من أجل فهم وظيفة الجينات التي أعرب عنها في منطقة محددة من الدماغ النامي ، بما في ذلك الجزيئات والجزيئات إشارات التوجيه محوار المحلية ونقل الجينات أو تدق خارج المطلوبة. استهداف الجينات في ضرب أو ضرب ، في المناطق المحلية من الممكن أن تؤدي مع تركيبة لجنة المساواة العرقية مع خط معينة ، وهو أمر شاق ومكلف ، وتستغرق وقتا طويلا. ولذلك ، فإن الأسلوب ترنسفكأيشن بسيط ، وهو في الرحم electroporation التقنية ، التي يمكن القيام بها مع وقت قصير ، قد تكون مفيدة لاختبار وظيفة ممكن من الجينات المرشحة السابقة لجيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 1،2. بالإضافة إلى ذلك ، في electroporation الرحم يستهدف المناطق من الدماغ حيث يوجد خط محدد لجنة المساواة العرقية موجودة ، وسوف تحد من الفتك الجنينية 3،4. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لelectroporation الرحم في الجمع بين نوعين مختلفين من الأقطاب الكهربائية لنقل الجينات بسيطة ومريحة في المناطق المستهدفة من الدماغ النامية. أولا ، سوف أسلوب عقد فريد من أجنة باستخدام الألياف البصرية كابل الألياف الخفيفة جعل أجنة صغيرة (من E9.5) مرئية لاستهداف الحمض النووي حقن المحلول إلى البطينين وإبرة أقطاب اكتب الى المنطقة المستهدفة 5،6 الدماغ. والزخرفة في الدماغ مثل منطقة القشرية يحدث في مرحلة جنينية مبكرة ، وبالتالي ، فإن هذه electroporation E9.5 المبكر من تقديم مساهمة كبيرة لفهم الحدث الزخرفة كامل المنطقة. الثانية ، والشكل الدقيق ليمنع الضرر الشعرية الرحم عن طريق الثقوب التي الإدراج من الشعيرات الدموية. وعلاوة على ذلك ، يتم إنشاء الشكل الدقيق للأقطاب الإبرة مع التنغستن والبلاتين وشحذ الأسلاك باستخدام الرمل ورقة ومعزولة مع طلاء الأظافر 7 ، وهو الأسلوب الذي يوصف بقدر كبير من التفصيل في هذا البروتوكول. هذا الأسلوب الفريد يسمح ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد في المناطق المحظورة من الدماغ ، وسوف يتسنى electroporated أجنة صغيرة. هذا سوف يساعد على فتح نافذة جديدة لكثير من العلماء الذين يعملون على تمايز الخلايا ، والهجرة الخلية ، والتوجيه محوار في المرحلة الجنينية المبكرة جدا. وعلاوة على ذلك ، فإن هذه التقنية تسمح للعلماء transfect DNA البلازميد إلى أجزاء من الدماغ العميق النامية مثل المهاد وتحت المهاد ، حيث لا يوجد الكثير من خصائص المنطقة وجود خطوط لجنة المساواة العرقية لتحقيق مكاسب من وظيفة (صندوق القناص) أو الخسارة من التحليلات (LOF) وظيفة.
Protocol
1. إعداد حل الشعرية والحمض النووي للحقن
- تنقية البلازميد الحمض النووي مع الإعدادية ، ماكسي أو أسلوب ما يعادلها ، وجعل تركيز النهائي من 2-3 ميكروغرام / ميكرولتر. قسامة 100 ميكروغرام من الحمض النووي ، إضافة 10μl صبغة خضراء سريع (1 ٪ الأسهم) والشركة المصرية للاتصالات (10MM قاعدة تريس ، 1MM EDTA الحل ، ودرجة الحموضة 8.0) ، وضبط حجم إلى 100 ميكرولتر لجعل تركيز الحمض النووي النهائية لمزيج الحقن ل1μg / ميكرولتر. تركيز الحمض النووي البلازميد يمكن تغيير يعتمد على حجم البلازميد ، وكذلك كفاءته ترنسفكأيشن ، الذي يحتاج الى اختبار فردي.
- تدور الحل الحمض النووي لمدة 5 دقائق على 14000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وجمع طاف لإزالة أي مخلفات.
- سحب الزجاج الأنابيب الشعرية الشعرية tubea باستخدام مجتذب micropipette. قرصة قبالة الطرف مع ملقط لجعل الطرف التي يبلغ قطرها ميكرون 20-30. قياس 800 ميكرومتر - 1 مم من طرف والتحقق من القطر الخارجي أقل من 60 ميكرون (الشكل 1A).
- ربط شعري إلى micromanipulator ، وملء مع الزيوت المعدنية. لملء الشعرية مع حلول الحمض النووي ، ويغرق في تلميح إلى حل وامتصاص الحل الحمض النووي.
2. عصا كهربائية البلاتين
المستخدمة هنا نحن أقطاب البلاتين عصا (Nepe الجينات ، CUY611P2 - 1) لelectroporate في المنطقة السطحية من الدماغ ، مثل القشرة (الشكل 1F).
3. إعداد الأقطاب الكهربائية الدقيقة
استخدام أقطاب كهربائية صغيرة لelectroporated إلى أجزاء من الدماغ العميق (أي المهاد وتحت المهاد) (الشكل 2B - E).
- واحدة من نهاية التنغستن (لأقطاب سلبية) والبلاتين (لأقطاب موجبة) والأسلاك الملفوفة على مطلية بالذهب ودبابيس ثابت مع parafilm. تضاف إلى سلك تنبع من مسحة القطن والتفاف كلا طرفي parafilm مع (الشكل 1B).
- شحذ بالتساوي غيض من الأسلاك مع الصنفرة حتى يصل قطرها 20-30 ميكرون 60 ميكرون والخارجي من 800 ميكرومتر - 1 ملم من طرف (الشكل 1C و D).
- تطبيق طبقة رقيقة من طلاء الأظافر إلى سلك للعزل. بعد طلاء الأظافر قد جفت ، استخدام مسحة القطن غارقة في الأسيتون لإزالته من طرف (حوالي 200 ميكرون من طرف). ملاحظة هامة : من أجل منع تلف رحم فأرة ، وجزء داخل ميكرومتر 800 - 1 ملم من طرف ينبغي أن يكون هناك أكثر من 70 ميكرومتر في القطر (الشكل 1E).
4. التحضير للجراحة
- تخدير ماوس الحوامل (E9.5 - E15.5). نظهر التخدير مع الصيدلانية الصوديوم بنتوباربيتال الدرجة (الجدول الثاني و 50 ميكروغرام لكل غرام من وزن الجسم ، وضخ intraperitoneally والانتظار لمدة 5 دقائق). بدائل الصوديوم بنتوباربيتال كمخدر تشمل الحقن الكيتامين / زيلازين أو التخدير الغاز (غاز هو الأفضل لإجراءات مدة قصيرة). وينبغي أن يتم حقن مع الانتباه لتجنب أي أجهزة ، وإلا فإن ذلك سيكون سببا للضرر في الرحم أو قتل الحيوانات. عندما يتم الملكية الفكرية الناجحة ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة أكثر من 95 ٪. كما يمكن إجراء عملية جراحية في الهواء الطلق البيئة. بدأت قبل العملية ، واختبار لعدم وجود استجابة من قبل الحيوانات لمعسر إصبع القدم لتأكيد مخدر.
- حلق الشعر من البطن باستخدام شفرة حلاقة وEtOH 50 ٪. تحضير الجلد بالتناوب مع الدعك من betadine والكحول (70 ٪).
- إجراء شق في خط الوسط في البطن مع مقص الغرامة وسحب كل أبواق الرحم بعناية في الصعود إلى 37 درجة مئوية قبل تسخينه الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) رطب الشاش والقطن ، والتي وضعت حول الجرح. الحفاظ على رطوبة الرحم مع برنامج تلفزيوني في جميع الأوقات.
- عقد كابل الألياف البصرية المرنة بين مؤشر وأصابع الوسطى ووضعه تحت قرن الرحم. تنظيف الكابل مع EtOH 70 ٪ قبل استخدامها. ليس هناك حاجة المجهر المكبر أو عن التصور. موقف الرحم بين كابل الألياف البصرية الضوئية الخفيفة والإبهام ، والضغط برفق في دفع الجنين أقرب إلى جدار الرحم.
5. حقن الحمض النووي وelectroporation
- عندما يتم وضع الجنين ، تضاف الزجاج الشعرية بعناية في البطين المستهدفة وتضخ حوالي 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي (الشكل 2A).
- لelectroporation سطحية لجزء من brainIf باستخدام العصا مع أقطاب البلاتين لelectoporation ، ضع أقطاب خارج الرحم واقترح تطبيق مربع موجة البقول الحالي وفقا لتعليمات لصنع (الجدول الأول). إذا usingFor electroporation إلى أعمق جزء من الدماغ ، nmicro electroporation ، يتم استخدام أقطاب كهربائية نوع eedle. حقن Iinsert التنغستن القطب السلبي الغرامة في الحمض النووي البطين ومسرى البلاتين في الرحم ومكان المنطقة المستهدفة بين قطبين ، ثم اقترح تطبيق مربع موجة البقول الحالية (الجدول الأول) (الشكل 2B).
6. آخر electroporation
- مكان الظهر في القرن الرحم على الأصلية والخمسينإينال الموقع مع وإضافة 500 ميكرولتر من 37 درجة مئوية قبل تسخينه برنامج تلفزيوني.
- الدرز الطبقة الداخلية مع خياطة الجراحية والطبقة الخارجية وثيق مع مقطع autoclipauto 9 ملم.
- مكان الحيوانات على لوحة التسخين لمدة 2 ساعة للسماح للانتعاش من التخدير. يمكن إعطاء المسكنات مثل كاربروفين البوبرينورفين أو للألم بعد العملية.
7. ممثل النتائج :
وترد بعض الأمثلة على electroporation القشرية من pCAG - EYFP بناء باستخدام أقطاب البلاتين العصا في نقاط زمنية مختلفة في الشكل رقم 32. وelectroporated العقول في E14.5 ، وE13.5 E15.5 ، وتحصد في يوم ما بعد الولادة (P) 6. AThe ntibody تلون RORc يكشف يتم الكشف عن موقف طبقة (4) والموقف من الخلايا EYFP transfected بواسطة تلوين الأضداد GFP ، وكلتا الصورتين هي التي فرضت السوبر (الشكل 3A وباء). الخلايا القشرية هي المسمى طبقة من الخلايا القشرية electroporated بوضوح مختلفة في كل تجربة (شكل 32) ، مما يوحي تعتمد على الوقت electroporation يجعل الطبقة القشرية محددة صندوق القناص / LOF ممكن.
جدوى للأجنة وكفاءة ترنسفكأيشن الخلية يختلف باختلاف عمر الجنين وموقع electroporation. يتم سرد العينات في الجدول 1 ، ومع ذلك ، ينبغي أن يكون الأمثل لكل الظروف electroporation اعتمادا على مرحلة وجزء من الدماغ.
Electroporation إلى الأنسجة العميقة مثل المهاد وتحت المهاد باستخدام أقطاب البلاتين عصا غالبا ما تعطي كفاءة منخفضة (الجدول 1). ويمكن حل هذه المشكلة عن طريق استخدام الأقطاب الكهربائية الدقيقة whichelectrodes ، والتي سوف تصل إلى مناطق عميقة من الدماغ. الشكل 3 (4) يوضح مثال pCAG - EYFP electroporation في الدماغ البيني النامية. يتم حقن محلول الحمض النووي البلازميد في البطين الثالث 3 في E11.5 وتليها electroporation الصغرى (الشكل 3C4C). ويقتصر مجال electroporated في المهاد ، حيث ان معظم محاور المشروع إلى القشرة (الشكل 3B4B). ويمكن التوقع محوار لطبقة 4 من القشرة يمكن تصور أيضا EYFP التي fillesfills يصل الخلايا العصبية بأكملها. (الشكل 3A4A).
الشكل 1. التخطيطي الكرتون يدل على الشكل الصحيح من الشعيرات الدموية. (أ) يتم سحبها أنبوب زجاجي الشعرية باستخدام مجتذب micropipette لجعل شكل معين. وهناك معلومات يتم إيقاف مقروص بواسطة ملقط لجعله 20-30 ميكرومتر. قياس 800 ميكرون ، 1MM من طرف (قوس أحمر) ، وتأكد من أن القطر الخارجي أقل من 60 ميكرون (الأخضر قوس). ملتف (B) واحدة من نهاية التنغستن أو أسلاك البلاتين في مطلي بالذهب دبابيس وثابتة مع parafilm. ثم استخدام ورقة الرمل لجعل الطرف لتصبح 20-30 ميكرون وقطرها الخارجي 60 ميكرون من 1 ملم من الحافة. (C) صورة سلك التنغستن قبل التشكيل. (D) صورة سلك التنغستن بعد تشكيل. (E) صورة سلك التنغستن بعد تطبيق طبقة رقيقة من طلاء الأظافر. شريط النطاق في البريد هو 10 ميكرومتر (أصغر حجم) لCE. (F) أقطاب البلاتين عصا (نيبا الجينات. CUY611P2 - 1). النطاق في شريط F هو 2 مم.
الرقم المخطط الكرتون 2. لإجراء العمليات الجراحية. (أ) رسم تخطيطي للحقن في البطين الجانبي أو الأجنة كبيرة (الجانب الأيسر) ، والثالثة في البطين 3 أو أجنة صغيرة (الجانب الأيمن). (ب) من مخطط electrporation بواسطة عصا القطب البلاتين (الجانب الأيسر) ، والإبرة الكهربائي نوع (الجانب الأيمن).
وكان electroporated الشكل 3. النامية الماوس telencephalon مع pCAG - EYFP في E13.5 (A) ، E14.5 (B) وE15.5 (C) والتي تحصد في P6. وكانت العقول مقطوع الاكليلية وملطخة GFP الضد أو الأضداد RORc بشكل منفصل ويتم دمج الصور. (أ) من Electroporation pCAG - EYFP البلازميد في E13.5 transfect العديد من الخلايا العصبية 4 طبقة. التي تتداخل مع طبقة 4 علامات RORc. (ب) من Electroporation pCAG - EYFP البلازميد في E14.5 transfect الخلايا ، والتي هي أكثر سطحية من 4 طبقة الخلايا العصبية. (ج) تسمية electroporation E15.5 الخلايا العصبية سطحية كثيرة مثل طبقة 2 / 3. مقياس شريط 200 ميكرومتر.
الشكل 4. ترنسفكأيشن من EYFP في المهادي القشري المحاوير (TCA). (A) هو كشف محطة TCA في طبقة قشرية 4 بواسطة تلوين الأضداد GFP. يستخدم RORc تلوين الأجسام المضادة للكشف عن موقف طبقة 4. تتخذ كل الصور من نفس القسم والمدمجة. (ب) كما هو مبين في موضع electroporation المهاد بواسطة تلوين الأضداد GFP وتلطيخ RORc ، الذي يقتصر التعبير في المهاد 11. (C) وتظهر الرسوم المتحركة التخطيطي لelectroporation مهادي والإسقاط TCA. مقياس شريط 200 ميكرومتر.
Discussion
في هذا البروتوكول ، وصفنا فقط فوائد هذه التقنية من ترنسفكأيشن pCAG - EYFP في منطقة محدودة من المخ الجنينية باستخدام أقطاب صغيرة على شكل مختلف. يوصف لمقارنة كفاءة ترنسفكأيشن بواسطة مروج مختلفة من قبل ، مما يدل على خصوصية الخلية من النوع 1. ومع ذلك ، هناك قيود لهذه التقنية ، مثل ترنسفكأيشن هو عابر فقط ويختلف تعتمد على البلازميد ، فإنه لا يملك أي خصوصية الخلية وأنه من الصعب السيطرة على عدد من الخلايا transfected. ThereforeHowever ، فإن الجمع بين هذا البروتوكول مع تقنيات أخرى لتوفير المزيد من فرص التلاعب وسائل مختلفة. أولا ، سوف تشمل المروج خلية معينة في الحمض النووي البلازميد تسمح الخلية من نوع ترنسفكأيشن محددة ، مثل الخلايا العصبية ، الخلايا الدبقية النجمية و. الثانية ، منذ ترنسفكأيشن هو عابر ، قد لا تكون مناسبة للعلماء الذين يريدون تحليل وظيفة الجين في الحياة في وقت لاحق. ولذلك ، فإن تركيبة مع transposase لجعل الحمض النووي البلازميد الاندماج في الجينوم تحويله إلى 8 ترنسفكأيشن مستقرة. وسوف القادم ، وإقرار تيت ، أو نظام تيت حالا تجعل من الممكن التلاعب في توقيت أو خلية نوع محدد التعبير الجيني في الخلايا العصبية 8. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن يجمع بين هذا البروتوكول مع محرض - ER - تاموكسيفين لجنة المساواة العرقية (T) recombinases 9 و 10 مراسلا الفئران.
وهذا الوصول واسعة من الأنسجة تغيير جذري تصاميم تجريبية تستخدم في علم الأعصاب.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل معهد العلوم بتبريد الدماغ (BSI) ، برنامج علوم الإنسان الحدودي (HFSP) (منحت لTS) وبرنامج بحوث بتبريد عضو مشارك (الجيش الأحمر الياباني ، التي منحت لMK) بتبريد معهد علوم الدماغ (BSI) ، برنامج علوم الإنسان الحدودي (HFSP) ممولة (منحت لTS) وبتبريد باحث مشارك جديد برنامج (الجيش الأحمر الياباني ، التي منحت لعضو الكنيست) هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| glass capillary tube | Stoelting Co. | 50611 | |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm autoclip | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| gold-plated pins | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
