Summary
Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.
Abstract
Om de functie van genen, uitgedrukt in specifieke regio van de zich ontwikkelende hersenen, waaronder signaalmoleculen en axon begeleiding moleculen, lokale gen-overdracht of knock-out is noodzakelijk te begrijpen. Gentargeting knock-in of knock-out in de lokale regio's is het mogelijk om met de combinatie met een specifieke CRE lijn, die is bewerkelijk, kostbaar en tijdrovend. Daarom zal een eenvoudige transfectie methode, een in de baarmoeder electroporatie techniek, die kan worden uitgevoerd met een korte tijd, handig zijn om de mogelijke functie van kandidaat-genen te testen voorafgaand aan het genereren van transgene dieren 1,2. In aanvulling op deze, in utero elektroporatie doelstellingen delen van de hersenen waar geen specifieke CRE lijn bestaat en zal embryonale letaliteit beperken 3,4. Hier presenteren we een methode om in utero elektroporatie het combineren van twee verschillende types van elektroden voor eenvoudige en comfortabele gentransfer in de doelgebieden van de zich ontwikkelende hersenen. Eerst zal een unieke methode holding van embryo's met behulp van een optische fiber optic kabel licht maken kleine embryo's (van E9.5) zichtbaar voor gerichte DNA-oplossing injectie in ventrikels en naald elektroden inbrengen om de beoogde hersengebied 5,6. De patronen van de hersenen, zoals corticale gebied voordoen in een vroeg embryonaal stadium, dus deze vroege elektroporatie van E9.5 een grote bijdrage aan de gehele gebied patronen gebeurtenis te begrijpen te maken. Ten tweede, de precieze vorm van een capillair voorkomt baarmoeder schade door het maken van gaten door insertie van het capillair. Bovendien worden de precieze vorm van de naald elektroden gecreëerd met wolfraam en platina draad en geslepen met behulp van schuurpapier en geïsoleerd met nagellak 7, een methode die is in detail beschreven in dit protocol. Deze unieke techniek maakt het mogelijk de transfectie van plasmide DNA in beperkte gebieden van de hersenen en in staat zal stellen kleine embryo's geëlektroporeerd. Dit zal helpen om, opent een nieuw venster voor veel wetenschappers die op celdifferentiatie, celmigratie, axon begeleiding werken in een zeer vroege embryonale stadium. Bovendien zal deze techniek kunnen wetenschappers plasmide DNA transfecteren in de diepe delen van de zich ontwikkelende hersenen, zoals thalamus en de hypothalamus, waar niet veel regio-specifieke CRE lijnen bestaan voor winst van de functie (GOF) of verlies van functie (LOF) analyses.
Protocol
1. De voorbereiding van capillaire en DNA-oplossing voor injectie
- Zuiver plasmide DNA met een Maxi-prep of gelijkwaardige methode, en maak een uiteindelijke concentratie van 2-3 ng / pl. Aliquot 100 ug DNA, voeg 10μl van snelle groene kleurstof (1% voorraad) en TE (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA-oplossing, pH 8,0) en stel een volume op 100 ul aan de laatste DNA-concentratie voor injectie mix aan te brengen in 1μg / ul. De concentratie van plasmide-DNA kan worden gewijzigd afhankelijk van de grootte van het plasmide, en ook de transfectie-efficiëntie, die moet apart worden getest.
- Spin van de DNA-oplossing gedurende 5 minuten bij 14.000 tpm bij kamertemperatuur en verzamel supernatant eventuele resten te verwijderen.
- Trek een glazen capillaire tubea glazen capillaire buizen met behulp van een micropipet trekker. Knijp af van de tip met een tang om de tip heeft een 20-30 micrometer diameter. Meet 800 um-1 mm van de tip en controleer of de uitwendige diameter is kleiner dan 60 micrometer (Fig. 1A).
- Sluit de capillaire aan de micromanipulator, en vul met minerale olie. Om het capillair te vullen met de DNA-oplossing, dompel de punt in de oplossing en zuigen van de DNA-oplossing.
2. Stick platina-elektroden
Hier gebruikten we houden platina-elektroden (Nepe gen, CUY611P2-1) tot electroporate in oppervlakkige regio van de hersenen, zoals de cortex (fig. 1F).
3. Voorbereiding van micro-elektroden
Gebruik van micro-elektroden geëlektroporeerd in de diepe delen van de hersenen (dat wil zeggen, de thalamus en de hypothalamus) (fig. 2B-E).
- Ene uiteinde van de wolfraam (voor de negatieve elektroden) en platina (voor positieve elektroden) draden is opgerold op vergulde pennen en vast met parafilm. Steek de draad om de stam van een wattenstaafje en wikkel beide uiteinden met parafilm (Fig. 1B).
- Gelijkmatig slijpen van de punt van de draad met schuurpapier tot hij 20 tot 30 micrometer uitwendige diameter en 60 micrometer van 800 um-1 mm van de tip (Fig. 1C en D).
- Breng een dun laagje nagellak om de draad voor de isolatie. Na de nagellak droog is, gebruik dan een aceton gedrenkte wattenstaafje om het te verwijderen uit de tip (ongeveer 200 urn uit de tip). Belangrijke opmerking: Om schade aan de baarmoeder van de muis te voorkomen, wordt het gedeelte binnen de 800 um-1 mm van de tip mag niet meer dan 70 micrometer in diameter (fig. 1E).
4. De voorbereiding van de operatie
- Verdoven een zwangere muis (E9.5-E15.5). Tonen we verdoving met farmaceutische kwaliteit natriumpentobarbital (II tabel; 50 pg per gram lichaamsgewicht, injecteren intraperitoneaal en wacht 5 min). Alternatieven voor natriumpentobarbital als een verdoving onder ketamine / xylazine injectie of gas anesthetica (gas is de voorkeur voor korte duur procedures). De injectie moet gebeuren met aandacht voor alle organen te voorkomen, anders zal toebrengen aan de baarmoeder beschadigen of dier te doden. Bij succes IP is gedaan, de overlevingskans is meer dan 95%. Ook de operatie kan worden uitgevoerd in de open-lucht-omgeving. Voordat begonnen met de operatie, test voor een gebrek aan respons van het dier te knijpen hun teen om verdoving te bevestigen.
- Scheer het haar uit de buik met behulp van een scheermesje en 50% EtOH. Bereid de huid met afwisselend scrubs van betadine en alcohol (70%).
- Maak een incisie in de buik middellijn met fijne schaar en alle baarmoederhoorns trek op een 37 ° C voorverwarmde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)-bevochtigd katoenen gaas, die wordt geplaatst rond de wond. Houd de baarmoeder vochtig met PBS alle van de tijd.
- Houd een flexibele glasvezelkabel tussen de wijs-en middelvinger en plaats het onder de baarmoeder hoorn. Schoon kabel met 70% EtOH voorafgaand aan gebruik. Geen microscoop of vergrootglas nodig is voor visualisatie. Plaats baarmoeder tussen de optische vezel licht optische kabel en de duim, en knijp voorzichtig bij het opdrijven van het embryo dichter bij de baarmoederwand.
5. Injectie van DNA en elektroporatie
- Wanneer embryo is geplaatst, plaatst glas zorgvuldig capillaire in doel ventrikel en injecteer ca. 1 ul van DNA-oplossing (Fig. 2A).
- Voor elektroporatie tot oppervlakkige deel van de brainIf gebruik met stok platina-elektroden voor electoporation, plaats de elektroden buiten de baarmoeder en de toe te passen stelde blokvormig stroompulsen volgens de aanwijzingen vervaardigen's (tabel I). Als usingFor elektroporatie naar diepere deel van de hersenen, nmicro elektroporatie, zijn eedle het type elektroden worden gebruikt. Iinsert een mooie tungsten negatieve elektrode in DNA geïnjecteerd ventrikel en een platina elektrode in de baarmoeder en plaats doelregio tussen twee elektroden, dan gelden stelde blokvormig stroom pulsen (tabel I) (Fig. 2B).
6. Na de elektroporatie
- Plaats de baarmoeder hoorn terug in zijn origrechtelijke locatie met en voeg 500 ul van 37 ° C voorverwarmde PBS.
- Suture de binnenste laag met chirurgische hechtingen en sluit buitenste laag met een 9 mm autoclipauto clip.
- Plaats dieren op een verwarmingselement gedurende 2 uur om het herstel van verdoving toe te staan. Pijnstillers zoals carprofen of buprenorfine kan worden toegediend voor de post-operatieve pijn.
7. Representatieve resultaten:
Enkele voorbeelden van corticale elektroporatie van pCAG-EYFP construeren met behulp van stok platina-elektroden op verschillende tijdstippen zijn weergegeven in figuur Figuur 32. Hersenen zijn geëlektroporeerd op E13.5, E14.5 en E15.5, en geoogst op postnatale dagen (P) 6. ADe ntibody kleuring van RORC onthult positie van laag 4 en de positie van EYFP getransfecteerde cellen worden onthuld door GFP antilichaam kleuring, en beide beelden zijn super opgelegd (Fig. 3A en B). Gelabelde corticale cellen zijn laag van geëlektroporeerde corticale cellen is duidelijk anders in elk experiment (Fig. 32), wat suggereert tijdsafhankelijke elektroporatie maakt corticale laag-specifieke GOF / LOF mogelijk.
De levensvatbaarheid van de embryo's en de efficiëntie van celtransfectie varieert afhankelijk van de leeftijd van embryo en de locatie van elektroporatie. Monsters staan vermeld in tabel 1, echter, moeten voorwaarden worden geoptimaliseerd voor elke elektroporatie afhankelijk van het stadium en een deel van de hersenen.
Elektroporatie in een diepe weefsel, zoals thalamus en hypothalamus met het gebruik van stok platina-elektroden geven vaak een laag rendement (tabel 1). Dit probleem kan worden opgelost door gebruik te maken van micro-elektroden whichelectrodes, die zal bereiken diepe delen van de hersenen. Figuur 3 toont 4 voorbeeld van pCAG-EYFP elektroporatie in de zich ontwikkelende diencephalon. Plasmide DNA-oplossing wordt geïnjecteerd in de 3 e ventrikel E11.5 en gevolgd door micro elektroporatie (Fig. 3C4C). Het geëlektroporeerde gebied is beperkt in de thalamus, waar het merendeel van de axonen project naar de cortex (afb. 3B4B). Axon projectie op laag 4 van de cortex kan ook gevisualiseerd worden door EYFP, die fillesfills van de gehele neuron. (Fig. 3A4A).
Figuur 1. Cartoon schematisch het aantonen van de juiste vorm van het capillair. (A) Een glazen capillair wordt getrokken met behulp van een micropipet puller om bepaalde vorm te maken. Een tip is afgeknepen door een tang om het 20-30 urn maken. Meet 800 um-1 mm van de punt (rode beugel) en zorg ervoor dat de uitwendige diameter is kleiner dan 60 micrometer (groen beugel). (B) Het ene uiteinde van de wolfraam of platina draden is opgerold op de vergulde pinnen en vaste met parafilm. Maak dan gebruik van schuurpapier om hun tip om te worden 20 tot 30 micrometer externe diameter en 60 micrometer, van 1 mm van de tip. (C) Afbeelding van de wolfraam draad voor de vormgeving. (D) Afbeelding van de wolfraam draad na het vormgeven. (E) Afbeelding van de wolfraam draad na het aanbrengen van dunne laag nagellak. Schaalbalk in E is 10 micrometer (kleinste schaal) voor CE. (F) Stick platina-elektroden (Nepa gen. CUY611P2-1). Schaalbalk in F is 2 mm.
Figuur 2. Cartoon schema van de chirurgische procedure. (A) Schematische weergave van injectie in laterale ventrikel of grote embryo's (links) en in de 3 e ventrikel of kleine embryo's (rechts). (B) Schema van electrporation door platina elektrode (links) en naald het type elektrode (rechts).
Figuur 3. Ontwikkelen muis telencephalon was geëlektroporeerd met pCAG-EYFP op E13.5 (A), E14.5 (B) en E15.5 (C) en geoogst op P6. Hersenen werden coupes coronale en gekleurd met GFP antilichaam of RORC antilichaam afzonderlijk en afbeeldingen worden samengevoegd. (A) Elektroporatie van pCAG-EYFP plasmide op E13.5 transfecteren veel laag 4 neuronen. die overlappen met laag 4 markers RORC. (B) Elektroporatie van pCAG-EYFP plasmide op E14.5 transfecteren cellen, die meer dan oppervlakkige laag 4 neuronen. (C) E15.5 elektroporatie label vele oppervlakkige neuronen, zoals layer 2 / 3. Schaalbalk 200 pm.
Figuur 4. Transfectie van EYFP in thalamo-corticale axonen (TCA). (A) TCA eindpunt in corticale laag 4 wordt onthuld door GFP antilichaam kleuring. RORC antilichaam kleuring is gebruikt om een positie van laag 4 zichtbaar te maken. Beide beelden zijn afkomstig uit dezelfde afdeling en samengevoegd. (B) Positie van elektroporatie in de thalamus wordt ook aangetoond door GFP antilichaam kleuring en RORC vlekken, die uitdrukking is beperkt in de thalamus 11. (C) Cartoon schema voor thalamische elektroporatie en TCA projectie worden weergegeven. Schaalbalk 200 pm.
Discussion
In dit protocol hebben we alleen de voordelen van de techniek van de pCAG-EYFP transfectie beschreven in de beperkte oppervlakte van een kleine embryonale hersenen met behulp van verschillende gevormde elektroden. Voor de vergelijking van de transfectie-efficiëntie van verschillende promotor is eerder beschreven, waaruit blijkt celtype specificiteit 1. Er zijn echter beperkingen voor de techniek, zoals de transfectie is slechts van voorbijgaande aard en varieert afhankelijk van het plasmide, heeft het geen enkele cel specificiteit en het is moeilijk om de controle aantallen van getransfecteerde cellen. ThereforeHowever, zal het combineren van dit protocol met andere technieken verder te bieden mogelijkheden voor verschillende manipulatie methoden. Ten eerste zal de integratie cel specifieke promoter in plasmide DNA laten cel-type specifieke transfectie, zoals neuronen, gliacellen en astrocyten. Ten tweede, omdat de transfectie van voorbijgaande aard is, is het niet geschikt is voor wetenschappers die willen de functie van het gen in het latere leven te analyseren. Daarom zullen combinatie met een transposase te maken plasmide DNA te integreren in het genoom omzetten in een stabiele transfectie 8. Vervolgens goedkeuring van de tet-on of tet-off systeem maakt het mogelijk om de timing of het celtype-specifieke genexpressie in neurale cellen acht te manipuleren. Als alternatief kan men dit protocol te combineren met tamoxifen-induceerbare Cre-ER (T) recombinases 9 en reporter muizen 10.
Deze brede toegankelijkheid van weefsels zal drastisch veranderen experimentele ontwerpen worden gebruikt in de neurowetenschappen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (toegekend aan TS) en RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, toegekend aan MK) RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (toegekend aan TS) en RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, toegekend aan MK) gefinancierde dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| glass capillary tube | Stoelting Co. | 50611 | |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm autoclip | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| gold-plated pins | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
