Summary
העברת גן שיטה למוח עכבר בפיתוח מתואר באמצעות שיטה ניתוחית ייחודית צורה מיוחדת של אלקטרודות. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד temporally מרחבית, אשר יסייעו מדעני מוח רבים בחקר התפתחות המוח.
Abstract
על מנת להבין את תפקידם של גנים הביע באזור מסוים של המוח המתפתח, כולל מולקולות איתות והדרכה מולקולות האקסון, העברת גנים מקומיים או עקום החוצה נדרשת. ג'ין מיקוד עקום או עקום החוצה לאזורים המקומי ניתן לבצע בשילוב עם קו Cre ספציפי, שהוא מייגע, יקר, זמן רב. לכן, שיטה transfection פשוט, טכניקה electroporation ברחם, אשר יכול להתבצע עם זמן קצר, יהיה בהישג יד כדי לבדוק את תפקוד אפשרי של גנים מועמדים לפני דור 1,2 חיות טרנסגניות. בנוסף לכך, ב electroporation ברחם מטרות אזורים במוח שבהם אין קו ספציפי Cre קיים, יגביל הקטלניות עובריים 3,4. כאן, אנו מציגים שיטה ב electroporation ברחם שילוב של שני סוגים שונים של אלקטרודות להעברת גנים קל ונוח לתחומי היעד של המוח המתפתח. ראשית, שיטת החזקה ייחודית של עוברים באמצעות סיב אופטי כבל אופטי אור יגרום עוברים קטנים (מ E9.5) גלוי להזרקה פתרון ממוקד דנ"א לתוך החדרים וסוג אלקטרודות מחט הכניסה לאזור המוח ממוקד 5,6. דפוסים של המוח כגון אזור בקליפת המוח מתרחשת בשלב עוברי מוקדם, ולכן, אלה electroporation מוקדם E9.5 תרומה גדולה להבין את האירוע כולו דפוסים אזור. שנית, את הצורה המדויקת של נימי מונע נזק הרחם על ידי יצירת חורים על ידי הכניסה של נימי. יתר על כן, הצורה המדויקת של אלקטרודות מחט נוצרות עם טונגסטן חוט פלטינה חידד שימוש בנייר חול מבודד עם לק 7, שיטה אשר מתואר בפירוט רב בפרוטוקול זה. זו טכניקה ייחודית זו מאפשרת transfection של DNA פלסמיד לאזורים מוגבלים של המוח יאפשר עוברי קטן להיות electroporated. זה יעזור, לפתוח חלון חדש של מדענים רבים שעובדים על התמיינות תאים, נדידת תאים, הדרכה האקסון עובריים בשלב מוקדם מאוד. יתרה מכך, טכניקה זו תאפשר למדענים transfect DNA פלסמיד לחלקים העמוקים של המוח המתפתח כגון התלמוס וההיפותלמוס, שם לא רבים ספציפיים באזור קווי Cre קיימים למטרות רווח של הפונקציה (GOF), או הפסד של (LOF) מנתח לתפקד.
Protocol
1. הכנת פתרון נימי ו-DNA להזרקה
- לטהר DNA פלסמיד עם הכנה, מקסי או בשיטה שוות ערך, ולעשות ריכוז סופי של 2-3 מיקרוגרם / μl. Aliquot 100 מיקרוגרם של ה-DNA, להוסיף 10μl מהיר של צבע ירוק (1% מניות) ו TE (10mm טריס הבסיס, 1mm פתרון EDTA, pH 8.0) ולהתאים נפח μl 100 על מנת להפוך את ריכוז ה-DNA הסופי לערבב זריקה כדי 1μg / μl. ריכוז ה-DNA פלסמיד יכול להיות שונה תלוי בגודל של הפלסמיד, כמו גם יעילות transfection שלה, אשר צריך להיבדק לגופו.
- ספין הפתרון DNA במשך 5 דקות ב 14,000 סל"ד בטמפרטורת החדר לאסוף supernatant כדי להסיר שאריות.
- משוך כוס זכוכית נימי צינורות tubea נימי באמצעות חולץ micropipette. לצבוט את הקצה עם מלקחיים כדי להטות את בעל קוטר 20-30 מיקרומטר. מדד 800 מיקרומטר-1 מ"מ מקצה לבדוק את קוטר חיצוני הוא פחות מ 60 מיקרומטר (איור 1A).
- חבר את נימי micromanipulator, ולמלא עם שמן מינרלי. כדי למלא את נימי עם פתרון ה-DNA, לצלול לתוך קצה הפתרון ולמצוץ את פתרון ה-DNA.
2. סטיק אלקטרודות פלטינה
כאן השתמשנו פלטינה מקל אלקטרודות (Nepe גן, CUY611P2-1) כדי electroporate לאזור שטחיים של המוח, כמו קליפת המוח (איור 1F).
3. הכנת מיקרו אלקטרודות
השתמש מיקרו אלקטרודות electroporated לחלקים העמוקים של המוח (כלומר, התלמוס וההיפותלמוס) (איור 2 ב-E).
- קצה אחד של טונגסטן (עבור אלקטרודות שליליות) ופלטינה (עבור אלקטרודות חיוביות) על חוטי הוא מפותל מצופה זהב סיכות קבוע עם parafilm. הכנס את החוט גזע של מקלון צמר גפן לעטוף את שני הקצוות עם parafilm (איור 1B).
- באופן שווה לחדד את קצה החוט עם נייר זכוכית עד שהוא מגיע 20-30 מיקרומטר קוטר חיצוני 60 מיקרומטר מ 800 מיקרומטר-1 מ"מ של קצה (איור 1C ו-D).
- החל מעיל דק של לק על חוט לבידוד. לאחר לק התייבש, להשתמש ספוגית צמר גפן ספוג אצטון כדי להסיר אותו מקצה (כ 200 מיקרומטר מקצה). הערה חשובה: כדי למנוע נזק הרחם של העכבר, את החלק בתוך 800 מיקרומטר-1 מ"מ של קצה צריך להיות לא יותר מ 70 מיקרומטר קוטר (איור 1E).
4. הכנת הניתוח
- הרדימי עכבר בהריון (E9.5-E15.5). אנו מדגימים הרדמה עם התרופות כיתה pentobarbital נתרן (לוח השנייה; 50 מיקרוגרם לכל גרם משקל גוף, להזריק intraperitoneally ולחכות 5 דקות). חלופות נתרן pentobarbital כחומר הרדמה כוללות הזרקת קטמין / Xylazine הרדמה או גז (גז עדיף נהלים זמן קצר). הזריקה צריכה להיעשות תוך תשומת לב כדי למנוע איברים, אחרת זה יגרום נזק הרחם או להרוג בעלי חיים. כאשר ה-IP מוצלח נעשה, שיעור ההישרדות הוא יותר מ -95%. כמו כן, הניתוח יכול להתבצע בסביבה באוויר הפתוח. בטרם החל המבצע הבדיקה, על חוסר התגובה של החיה כדי צובט הבוהן שלהם כדי לאשר הרדמה.
- לגלח את שיער מהבטן באמצעות סכין גילוח ו EtOH 50%. הכינו את העור לסירוגין סקראבס של בבטאדין ואלכוהול (70%).
- עושים חתך בכל קו האמצע הבטן במספריים דק ולהוציא את כל הקרניים הרחם בזהירות על 37 מעלות צלזיוס מראש חימם פוספט בופר סליין (PBS), לחלח גזה כותנה, אשר ממוקם באזור הפצע. שמרו על לחות הרחם עם PBS כל הזמן.
- החזק כבל סיב אופטי גמיש בין המדד לבין האצבעות באמצע ולמקם אותו תחת קרן הרחם. כבל נקי עם EtOH 70% לפני השימוש. לא מיקרוסקופ או זכוכית מגדלת נדרשת ראיה. מיקום הרחם בין כבל סיב אופטי אור אופטיים את האגודל, וסוחטים בעדינות לדחוף את העובר קרוב לקיר הרחם.
5. הזרקה של DNA electroporation
- כאשר העובר ממוקם, הכנס זכוכית נימי בזהירות לתוך החדר היעד להזריק 1 כ μl של פתרון ה-DNA (איור 2 א).
- עבור electroporation לחלק השטחי של brainIf באמצעות אלקטרודות פלטינה עם מקל electoporation, במקום אלקטרודות מחוץ לרחם וליישם הציע גל מרובע פעימות הנוכחי על פי הוראה של ייצור (טבלה I). אם electroporation usingFor לחלק עמוק יותר של המוח, electroporation nmicro, אלקטרודות סוג eedle משמשים. Iinsert אלקטרודה טונגסטן בסדר שלילי מוזרק לתוך ה-DNA החדר ואת אלקטרודת פלטינה לתוך הרחם היעד באזור מקום בין שתי אלקטרודות, ולאחר מכן להחיל הציע גל מרובע פעימות הנוכחי (טבלה I) (איור 2 ב).
6. הודעה electroporation
- הנח את גב קרן הרחם ב 'מקורית שלהמיקום inal עם ולהוסיף 500 μL של 37 ° C טרום חימם PBS.
- תפר את השכבה הפנימית עם תפר כירורגית השכבה החיצונית הדוק עם קליפ autoclipauto 9 מ"מ.
- בעלי המקום על כרית חימום למשך 2 שעות, כדי לאפשר ההתאוששות מן ההרדמה. משככי כאבים כגון carprofen או עצירות יכולה להינתן על הכאב שלאחר הניתוח.
7. נציג התוצאות:
כמה דוגמאות של electroporation קליפת המוח של pCAG-EYFP לבנות באמצעות אלקטרודות פלטינה מקל בנקודות זמן שונות מוצגות באיור איור 32. מוחות הם electroporated ב E13.5, E14.5 ו E15.5, וקצרו ביום הלידה (P) 6. AThe מכתים ntibody של RORc מגלה עמדתו של שכבת 4 ואת המיקום של תאים EYFP transfected מתגלים כתמים על ידי נוגדן ה-GFP, והתמונות הן סופר שהוטל (איור 3A ו-B). תאים בקליפת המוח תווית הם שכבה של תאים בקליפת המוח electroporated הוא בבירור שונה בכל ניסוי (איור 32), אשר טוען תלוי זמן electroporation קליפת המוח הופכת שכבת ספציפי GOF / LOF אפשרי.
הכדאיות של עוברים והיעילות של transfection התא משתנה בהתאם לגיל העובר ואת המיקום של electroporation. דוגמאות מפורטות על טבלה מס '1, לעומת זאת, התנאים צריכים להיות מותאמים לכל electroporation בהתאם הבמה חלק של המוח.
Electroporation לתוך רקמות עמוק כגון התלמוס וההיפותלמוס עם פלטינה באמצעות אלקטרודות מקל לעתים קרובות לתת יעילות נמוכה (טבלה 1). בעיה זו ניתן לפתור באמצעות מיקרו אלקטרודות whichelectrodes, אשר תגיע לחלקים העמוקים של המוח. איור 3 4 מראה דוגמה electroporation pCAG-EYFP לתוך diencephalon המתפתח. פתרון ה-DNA פלסמיד מוזרק לתוך ה -3 החדר בבית E11.5 ואחריו מיקרו electroporation (איור 3C4C). האזור electroporated מוגבל בתלמוס שבה רוב הפרויקט אקסונים אל הקורטקס (איור 3B4B). הקרנת אקסון לשכבה 4 של קליפת ניתן דמיינו גם EYFP, אשר fillesfills את נוירון כולו. (איור 3A4A).
באיור 1. סכמטית Cartoon הוכחת את הצורה הנכונה של נימי. (א) צינור זכוכית נימי הוא משך באמצעות חולץ micropipette לעשות צורה מסוימת. טיפ כבוי צבט ידי מלקחיים כדי לעשות את זה 20-30 מיקרומטר. מדד 800 מיקרומטר-1mm מקצה (סוגר אדום) ולוודא כי קוטר חיצוני הוא פחות מ 60 מיקרומטר (סוגר ירוק). (ב) קצה אחד של טונגסטן או חוטי פלטינה הוא מפותל על מצופה זהב סיכות קבוע עם parafilm. ואז להשתמש בנייר חול לבצע קצה שלהם להפוך 2-30 קוטר חיצוני מיקרומטר ו 60 מיקרומטר 1 מ"מ של קצה. (ג) תמונה של חוט טונגסטן לפני בעיצוב. (ד) תמונה של חוט טונגסטן לאחר עיצוב. (ה) תמונה של חוט טונגסטן לאחר החלת מעיל דק של לק. בר סולם ב E הוא 10 מיקרומטר (בקנה מידה קטן) עבור לספירה. (F) פלטינה Stick אלקטרודות (גן Nepa. CUY611P2-1). בר סולם בפה הוא 2 מ"מ.
איור 2. Cartoon סכימה של הליך כירורגי. (א) תרשים של הזרקה לתוך החדר לרוחב או עוברי גדול (צד שמאל) לתוך החדר ה -3 או עוברי קטן (צד ימין). (ב) תרשים של electrporation ידי אלקטרודה פלטינה מקל (צד שמאל) על ידי אלקטרודה מחט סוג (צד ימין).
איור 3. פיתוח עכבר telencephalon היה electroporated עם pCAG-EYFP E13.5 ב (א), E14.5 (B) E15.5 (C) שנקטפו ב P6. המוח נותחו העטרה ומוכתמת עם נוגדן GFP או נוגדן RORc בנפרד ותמונות ימוזגו. (א) electroporation של pCAG-EYFP פלסמיד ב E13.5 transfect 4 נוירונים רבים בשכבה. אשר חפיפה עם שכבת סמנים RORc 4. (ב) electroporation של pCAG-EYFP פלסמיד ב E14.5 תאים transfect, שהם שטחיים יותר שכבה 4 נוירונים. (ג) E15.5 תווית electroporation נוירונים שטחית רבים כגון שכבה 2 / 3. סולם בר 200 מיקרומטר.
איור 4. Transfection של EYFP לתוך thalamo-קליפת המוח אקסונים (TCA). (א) הסופית TCA בשכבה קורטיקליים 4 מתגלה על ידי מכתים נוגדן ה-GFP. מכתים RORc הנוגדן משמש כדי לחשוף את המיקום של שכבה 4. התמונות הן לקוחים סעיף זהה הממוזג. (ב) קבוצה של electroporation אל התלמוס מוצג גם על ידי צביעת נוגדן ה-GFP ו מכתים RORc, אשר הביטוי מוגבל של התלמוס 11. (ג) סכמטית Cartoon עבור electroporation thalamic והשלכה TCA מוצגים. סולם בר 200 מיקרומטר.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנחנו רק תיאר היתרונות של השיטה של transfection pCAG-EYFP לאזור המוגבל של מוח העובר קטן באמצעות אלקטרודות בצורת שונות. לשם השוואה של יעילות transfection על ידי האמרגן שונה שתואר לעיל, אשר מציגה סוג תא סגוליות 1. עם זאת, ישנן מגבלות על הטכניקה, כגון transfection הוא חולף רק משתנה תלוי פלסמיד, אין לו שום ייחוד תא וקשה לשלוט במספרים של תאים transfected. ThereforeHowever, שילוב של פרוטוקול זה עם טכניקות אחרות יהיה עוד לספק אפשרויות שיטות מניפולציה שונות. ראשית, שילוב מקדם תאים ספציפיים לתוך פלסמיד דנ"א יאפשר לתא מסוג transfection ספציפיים, כגון נוירונים ותאי גלייה ו האסטרוציטים. שנית, מאז transfection הוא חולף, זה לא מתאים מדענים שרוצים לנתח את הפונקציה של הגן בשלב מאוחר יותר בחיים. לכן, בשילוב עם transposase לעשות פלסמיד דנ"א להשתלב בגנום יהיה להמיר אותו לתוך transfection יציב 8. האימוץ הבא של ט או ט את המערכת תאפשר לתפעל את העיתוי או סוג תא ספציפי ביטוי גנים בתאים עצביים 8. לחלופין, אפשר לשלב את זה עם פרוטוקול ועין מתנהלת-טמוקסיפן Cre-ER (T) recombinases 9 ועכברים הכתב 10.
זו נגישות רחבה של רקמות יהיה דרסטי לשנות עיצובים ניסיוניים בשימוש במדעי המוח.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכון למדעי המוח RIKEN (BSI), תוכנית האדם Frontier Science (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN תוכנית ג'וניור עמית מחקר (JRA, העניק לח"כ) RIKEN המכון למדעי המוח (BSI), תוכנית אנוש המדע Frontier (HFSP) (הוענק TS) ו RIKEN עמית ג'וניור תוכנית המחקר (JRA, העניק לח"כ) מימנה את העבודה הזאת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| glass capillary tube | Stoelting Co. | 50611 | |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm autoclip | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| gold-plated pins | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
