Summary
개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.
Abstract
신호 분자와 축삭지도 분자, 지방 유전자 전송 또는 노크 아웃이 필요합니다을 포함하여 개발 두뇌의 특정 영역에서 표현 유전자의 기능을 이해하기 위해서. 지역 지역에 안으로 또는 노크 아웃 타겟 유전자는 특정 힘드는, 비용이 많이 드는 CRE 라인, 그리고 시간이 소요와 함께 함께 수행할 수 있습니다. 따라서, 간단한 transfection 방법, 짧은 시간에 수행할 수 있습니다에서 utero의 electroporation 기술은, 사전에 유전자 변형 동물의 1,2 세대의 후보 유전자의 가능한 함수를 테스트하는 것이 편리할 것입니다. 이 외에도, utero의 electroporation에 특정 CRE 라인은 존재하지 않는 두뇌의 영역을 대상으로하고, 배아 파괴 장면을 보여 주죠에게 3,4를 제한합니다. 여기, 우리는 개발 두뇌의 대상 영역으로 간단하고 편리한 유전자 전달을위한 전극의 두 가지 종류의 결합 utero의 electroporation에의 방법을 제시한다. 첫째, 광학 광섬유 조명 케이블을 사용하여 태아의 독특한 지주 방법은 심실 및 타겟 뇌 영역 5,6에 바늘 형태 전극 삽입에 타겟 DNA 용액 주입을위한 보이는 작은 배아 (E9.5에서) 할 것입니다. 같은 피질 영역으로 뇌의 patterning 따라서, E9.5에서 이러한 초기 electroporation은 전체 지역 patterning 이벤트를 이해하기 위해 큰 공헌을 초기 배아 단계에서 발생합니다. 둘째, 모세관의 정확한 모양은 모세 삽입하여 구멍을함으로써 자궁 손상을 방지합니다. 또한, 바늘 전극의 정확한 모양은 텅스텐과 백금 와이어로 만든 모래 종이를 사용하여 날카롭게하고 매니큐어 7이 프로토콜 큰 자세히 설명되어있는 방법으로 절연하고 있습니다. 이 독특한 기술은 두뇌의 제한된 영역에 플라스미드 DNA의 transfection을 허용 작은 배아가 electroporated 수 있도록합니다. 이것은 아주 초기 배아 단계에서 세포 분화, 세포 이주, 축삭지도에 최선을 다하고 있습니다 많은 과학자를위한 새로운 창을 열고하는 데 도움이 될 것입니다. 또한,이 기술은 과학자들이 이러한 많지 않아 특정 지역과 관련된 CRE 라인 함수의 이득 (고프) 또는 기능 (LOF) 분석의 손실에 대해 존재하는 시상과 시상 하부로 개발 두뇌의 깊은 부분으로 플라스미드 DNA를 transfect 수 있습니다.
Protocol
1. 분사에 대한 모세관과 DNA 솔루션의 준비
- 맥시 - 준비 또는 이와 동등한 방법으로 플라스미드 DNA를 정화, 후 2-3 μg / μl의 최종 농도합니다. 나누어지는 DNA의 100 μg가 빠르고, 녹색 염료 (1 % 주식) 및 TE의 10μl를 추가 (10mM 트리스베이스, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션, 산도 8.0)와 1μg /에 분사 혼합의 최종 DNA 농도를 100 μl로 음량을 조절 μl. 플라스미드 DNA의 농도를 변경할 수있다는 개별적으로 테스트해야 자사의 transfection 효율 또한 플라스미드의 크기에 따라 달라집니다합니다.
- 실온에서 14,000 rpm으로 5 분 DNA 솔루션을 스핀하고 잔류물을 제거 뜨는 수집합니다.
- micropipette의 풀러를 사용하여 유리 모세관 tubea 유리 모세관 튜브를 당겨. 팁는 20-30 μm의 직경을 가지고 만들어 포셉와 팁을에서 핀치. 끝에서 800 μm의 - 1mm를 측정하고 외부 직경 미만 60 μm의 (그림 1A)입니다 확인하십시오.
- micromanipulator에 모세를 연결하고, 미네랄 오일과 함께 입력합니다. DNA 솔루션 잠수함 솔루션에 팁으로 모세관을 입력하고 DNA 용액을 빨아합니다.
2. 백금 전극을 스틱
여기에는 피질 (그림 1 층)로 두뇌의 표면 지역에 electroporate에 충실 플래티넘 전극 (Nepe 유전자, CUY611P2 - 1)을 사용합니다.
3. 마이크로 전극의 준비
두뇌 (즉, 시상과 시상 하부) (그림 2B - E)의 깊은 부분으로 electroporated에 마이크로 전극을 사용하십시오.
- 하나 텅스텐 끝 (부정적인 전극) 및 백금 (긍정적인 전극)을 전선은 금도금 핀에 코일과 parafilm로 고정됩니다. 면봉의 줄기에 철사를 삽입하고 parafilm (그림의 1B)와 양쪽을 포장.
- 그것이 800 20-30 μm의 외부 직경 60 μm의 μm의 - 1 끝의 mm (그림 1C 및 D)를 도달할 때까지 균일하게 사포와 와이어의 끝부분을 날카롭게.
- 절연을위한 와이어 매니큐어가 손톱의 얇은 외투를 적용하십시오. 매니큐어가 건조되면, 팁 (끝부분에서 약 200 μm의)에서 제거하는 아세톤 묻은 면봉을 사용합니다. 중요 참고 : 마우스의 자궁에 손상을 방지하기 위해, 800 시간 부분 μm의 - 1 끝의 mm 직경에 더 이상 70 이상 μm의 (그림 1E)해야합니다.
4. 수술 준비
- 임신 마우스 (E9.5 - E15.5)을 마취. 우리는 제약 학년 나트륨 pentobarbital로 anesthetization을 증명 (표 II, g 체중 당 50 μg은 intraperitoneally을 주입하고 5 분 기다). 마취로 pentobarbital 나트륨에 대한 대안은 케타민을 / Xylazine 주입 또는 가스 anesthetics을 (가스 짧은 기간 절차에 대한 것이 바람직합니다)가 있습니다. 주사 어떤 기관을 피하기 위해주의와 함께 이루어져야합니다, 그렇지 않으면 그것은 자궁가 손상되거나 동물을 죽이는 원인이됩니다. 성공적인 IP가 완료되면 생존율 이상 95%입니다. 또한 수술은 야외 환경에서 수행할 수 있습니다. 전에 마취를 확인하기 위해 발가락을 곤란하게하기 위해 동물의 응답의 부족에 대한 작업, 테스트를 시작했다.
- 면도날과 50 % EtOH를 사용하여 복부에서 머리를 면도. betadine과 알코올의 스크럽 (70 %)을 교대로 피부를 준비합니다.
- 고급 가위로 복부 정중선에서 절개를하고 37에 신중하게 모든 자궁 뿔을 꺼내 ° C 사전 예열 인산 버퍼 호수 (PBS) moistened 상처 주위에 배치됩니다 코튼 거즈를. PBS 당시의 모든 자궁 촉촉한 보관하십시오.
- 색인과 중간 손가락 사이 유연한 광섬유 케이블을 잡고 자궁 경적 아래로 놓으십시오. 사용하기 전에 70 % EtOH로 청소 케이블. 아무도 현미경이나 돋보기가 시각화가 필요하지 않습니다. 위치 광섬유 조명 광 케이블과 엄지손가락 사이에 자궁과 가까운 자궁 벽에 배아를 밀어 부드럽게 쥐어 짜기.
5. DNA와 electroporation의 분사
- 태아가 위치하면, 유리는 대상 꽂혔어 조심스럽게 모세관과 DNA 솔루션의 약 1 μl (그림 2A)를 주입 삽입합니다.
- electoporation에 대한 스틱 백금 전극과 함께 사용하여 brainIf의 표면 부분 electroporation 들어, 자궁의 외부 전극을 배치하고 (표 I) 제조의 지시에 따라 제안 평방 파 전류 펄스를 적용합니다. 두뇌의 깊은 부분에 usingFor의 electroporation은 nmicro의 electroporation은 eedle 입력 전극을 사용하는 경우. Iinsert DNA에 잘 텅스텐 음극은 평방 파 전류 펄스 (표 I) (그림 2B)를 제안 적용 후, 두 전극 사이에 자궁과 장소 대상 지역으로 뇌실과 백금 전극을 주입.
6. 포스트 electroporation
- 는 원본보다 실적이있는 자궁 호른 다시 플레이스inal과 위치와 37 ° C 사전 예열 PBS 500 μL를 추가합니다.
- 9mm autoclipauto 클립과 수술 봉합과 가까운 바깥쪽 레이어와 내부 레이어를 봉합해.
- 2 시간 동안 가열 패드 플레이스 동물은 마취에서 회복을 허용합니다. 이러한 carprofen 또는 buprenorphine 같은 진통제는 통증에 대한 게시물 수술 시행하실 수 있습니다.
7. 대표 결과 :
pCAG - EYFP의 대뇌 피질의 electroporation의 몇 가지 예입 다른 시간 지점에서 스틱 백금 전극을 사용하는 구성은 그림 그림 32에 표시됩니다. 두뇌는 E13.5, E14.5 E15.5과에서 electroporated하고, 출생 후의 일 (P) 6 수확하고 있습니다. RORc의 AThe ntibody의 얼룩은 레이어 4 EYFP transfected 세포의 위치의 위치가 GFP의 항체 염색법에 의해 밝혀 아르 공개, 두 이미지 (그림 3A와 B) 슈퍼 부과됩니다. 라벨 피질 세포는 electroporated 대뇌 피질 세포의 계층이 명확하게 시간 의존 electroporation은 대뇌 피질의 특정 계층 고프 / LOF 가능하게 제시 각 실험 (그림 32)에 차이가 있습니다.
세포 transfection의 배아 및 효율성의 생존 능력이 배아의 연령 electroporation의 위치에 따라 다릅니다. 샘플 표 1에 나열되어 있습니다, 그러나, 조건이 무대와 두뇌의 한 부분에 따라 각각의 electroporation을 위해 최적화해야합니다.
이러한 스틱 백금 전극을 이용하여 시상과 시상 하부로 깊은 조직으로 Electroporation은 종종 낮은 효율성을 (표 1) 제공합니다. 이 문제는 마이크로 전극에게 두뇌의 깊은 부분에 도달합니다 whichelectrodes를 사용하여 해결할 수 있습니다. 그림 3 개발 diencephalon에 pCAG - EYFP electroporation 4 보여주는 예제. 플라스미드 DNA 솔루션은 E11.5에서 제 3 뇌실로 주입 및 마이크로 electroporation (그림 3C4C)이옵니다. electroporated 영역은 시상 제한됩니다 어디 피질 (그림 3B4B)에 axons 프로젝트의 대부분. 피질의 레이어 4 액슨 투영은 전체 신경 세포를 fillesfills EYFP에 의해 또한 시각하실 수 있습니다. (그림 3A4A).
그림 1. 모세관의 정확한 모양을 보여주는 만화의 약도. (A) 유리 모세관 특정 형태를 만들기 위해 micropipette의 풀러를 사용하여 뽑아 있습니다. 팁는 20-30 μm의를 만들기 위해 집게로 슬쩍 꺼져 있습니다. 팁 (레드 브래킷)에서 800 μm의 - 1mm를 측정하고 외부 직경 미만 60 μm의 (녹색 브래킷)되어 있는지 확인합니다. 텅스텐 또는 백금 와이어 (B) 한쪽은 금도금 핀에 코일과 parafilm로 고정됩니다. 그런 다음 끝의 1mm 20-30 μm의 외부 직경 60 μm의되기 위해 자신의 팁을를 만들기 위해 모래 종이를 사용합니다. 텅스텐 와이어 (C) 이미지 구체화하기 전에. 성형 후 텅스텐 와이어 (D) 이미지. 매니큐어의 얇은 외투를 적용 후 텅스텐 와이어 (E) 이미지. E 규모 막대 CE 10 μm의 (작은 규모)입니다. (F) 스틱 백금 전극 (NEPA 유전자. CUY611P2 - 1). F 규모 막대는 2mm입니다.
수술의 그림 2. 만화 스키마. 측면 뇌실이나 대형 배아 (왼쪽)로, 3 차의 뇌실 또는 작은 태아 (오른쪽)로 분사의 (A) 다이어그램. 백금 스틱 전극 (왼쪽)와 바늘 용접봉 (오른쪽)으로 electrporation의 (B) 다이어그램.
그림 3. 마우스 telencephalon 개발은 E13.5 (A), E14.5 (B)와 E15.5 (C)에서 pCAG - EYFP와 electroporated와 P6에서 수확했다. 뇌는 따로 코로나 sectioned 및 GFP 항체 또는 항체 RORc 물들일되었고 이미지가 병합됩니다. E13.5 transfect 많은 계층 4 뉴런에서 pCAG - EYFP 플라스미드의 (A) Electroporation. 어느 4 마커 RORc 레이어와 중복됩니다. 레이어 4 뉴런보다 표면 아르 E14.5 transfect 세포에서 pCAG - EYFP 플라스미드의 (B) Electroporation. 이러한 계층 3분의 2 등 (C) E15.5 electroporation 레이블 많은 천박한 뉴런. 스케일 바 200 μm의.
그림 4. thalamo - 대뇌 피질의 axons (TCA)에 EYFP의 Transfection. (A) 대뇌 피질의 레이어 4 TCA 터미는 GFP의 항체 염색법에 의해 드러났습니다. RORc 항체의 얼룩은 레이어 4의 위치를 공개하는 데 사용됩니다. 두 이미지는 동일한 섹션에서 촬영한과 병합됩니다. (B) 시상에 electroporation의 위치는 표현이 시상 11 제한되어 GFP의 항체 얼룩과 RORc 염색법에 의해 표시됩니다. (C) thalamic electroporation과 TCA 프로젝션을위한 만화의 약도가 표시됩니다. 스케일 바 200 μm의.
Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 서로 다른 모양의 전극을 사용하여 작은 배아 두뇌의 제한 구역에 pCAG - EYFP transfection의 기술의 장점을 설명했다. 다른 발기인에 의해 transfection 효율 비교는 이전에 설명한 경우, 이것은 세포 유형 특이성 1 보여줍니다. 그러나, transfection 등 기술에 대한 제한은 일시적이고 플라스미드에 따라 차이가있다, 그것은 모든 세포 특이성을하지 않으며 그것은 transfected 세포의 숫자를 제어하기 어렵다. ThereforeHowever은 다른 기법이 프로토콜을 결합하면 더욱 다양한 조작 방법에 대한 가능성을 제공합니다. 첫째, 플라스미드 DNA에 특정 셀 모터를 통합하면 이러한 뉴런, glial 세포 및 astrocytes 같은 셀 타입의 특정 transfection을하실 수 있습니다. 둘째, transfection이 과도이기 때문에, 그것은 나중에 유전자의 기능을 분석하려는 과학자에 적합하지 않습니다. 따라서 플라스미드 DNA가 게놈에 통합하기 위해 transposase와 조합은 안정적인 transfection 8로 변환됩니다. tet - 또는 tet - 오프 시스템의 다음, 채택은 가능한 8 신경 세포의 타이밍이나 세포 유형 특정 유전자 발현을 조작하는 것입니다. 또는, 하나는 tamoxifen - inducible Cre 호텔 - ER (T) recombinases 9 기자 마우스 10이 프로토콜을 조합하여 사용할 수 있습니다.
조직의 광범위한 접근은 크게 신경 과학에서 사용되는 실험 설계 변경됩니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 RIKEN 뇌 과학 연구소 (BSI), 인간 프론티어 과학 프로그램 (HFSP) (TS에게 수여) 및 RIKEN 주니어 리서치 연결 프로그램 (JRA, MK에게 수여) RIKEN 뇌 과학 연구소 (BSI), 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 투자되었다 (HFSP) (TS에게 수여) 및 RIKEN 주니어 리서치 연결 프로그램 (JRA, MK에게 수여)이 작품을 후원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M Systems | 797600 | |
| bare platinum wire diameter 125 μm | A-M Systems | 767000 | |
| Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 | |
| glass capillary tube | Stoelting Co. | 50611 | |
| micromanipulator | KD Scientific | KDS310 | |
| scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5865 | |
| pulse generator | A-M Systems | Model 2100 | |
| 9 mm autoclip | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9260 | |
| gold-plated pins | World Precision Instruments, Inc. | 5482 | |
| RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |
References
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240, 237-246 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Imayoshi, I., Shimogori, T., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Hes genes and neurogenin regulate non-neural versus neural fate specification in the dorsal telencephalic midline. Development. 135, 2531-2541 (2008).
- Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex. Development. 131, 5639-5647 (2004).
- Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development Growth & Differentiation. 50, 499-506 (2008).
- Takahashi, Y., Watanabe, T., Nakagawa, S., Kawakami, K., Sato, Y. Avian Embryology. Methods in Cell Biology. Vol 87, 2nd Edition, Elsevier Academic Press Inc. 271-271 (2008).
- Feil, R. Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 10887-10890 (1996).
- Indra, A. K. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ERT and Cre-ERT2 recombinases. Nucleic Acids Research. 27, 4324-4327 (1999).
- Nakagawa, Y., O'Leary, D. D. M. Dynamic patterned expression of orphan nuclear receptor genes ROR alpha and ROR beta in developing mouse forebrain. Developmental Neuroscience. 25, 234-244 (2003).
