Summary
我々は、さまざまな神経伝達物質によく制御された方法で脳のスライスのマイクロスケールの表面を露出させる標準的な電気生理学的セットアップと統合可能なシンプルなマイクロ流体デバイスの作製を実証する。
Abstract
我々は、簡単に既存の電気生理学のセットアップに統合することができる2つのレベルのマイクロ流体デバイスの作製を実証している。 2レベルのマイクロ流体デバイスは、2段階の標準的なリソグラフィプロセス1をネガ型レジストを用いて製造されています。最初のレベルは、それぞれの終了時に入口と出口ポートを持つマイクロチャネルが含まれています。番目のレベルは、チャネル長の中間に位置し、チャネルの幅と一緒に中央にマイクロスケールの円形の穴が含まれています。受動的な揚水方法は、入口ポートから出口ポート2に流体をポンプするために使用されます。マイクロ流体デバイスは、既製の灌流チャンバーと統合され、電気生理学のセットアップとのシームレスな統合を可能にしています。流体は出口ポートに向かってマイクロチャネルを介して吸気ポートの流量で導入されており、また血流の浴中にマイクロチャネルの上部にある円形の開口部を通って脱出。このように灌流チャンバーのバスで、マイクロ流体デバイス上に置かれた脳のスライスの底面は、別の神経伝達物質で公開することができます。マイクロ流体デバイスのマイクロスケール厚さと材料の透過的な性質[ガラスカバースリップとPDMS（ポリジメチルシロキサン）]マイクロ流体デバイスは、脳スライスの顕微鏡を可能にするために使用。マイクロ流体デバイスは、脳スライスの微小環境に導入された化学的刺激の変調を（空間的および時間的の両方）が可能です。
Protocol
SU - 8金型製作
マスターの準備
- シリコンウエハ基板上にSU - 8のマスターは、2段階の標準的なネガ型レジストリソグラフィプロセスを用いて調製される。
- シリコンウエハ上のアライメントマークは、（ウェーハの外周に沿って位置する）これらの構造体の高さとカミソリの刃を使って削除している実際のデバイス構造以上のものです。
- シリコンウエハは、イソプロピルアルコールで洗浄し、N 2の流れで乾燥させる。最も高いデバイスの構造よりも小さい厚さでテープで作られた支柱は、ウェハの四辺上のアライメントマークを交換してください。
注：支柱の高さが最も高いデバイス構造を超えている場合は、スルーホールPDMSモールドに形成されていません。 - マスターのシリコンウエハは、室温でホットプレート上に置かれる。
PDMSの溶液の調製
- ポリジメチルシロキサン（PDMS）ソリューションの4グラムは十分に硬化剤1部とシリコーンエラストマーの10部を混合することによって調製される。
注意 ：2つの溶液をPDMSモールド全体に類似した物性を得るために均一に混合されていることを確認します。 - 混合プロセス中にPDMSの溶液中で生成された気泡は、真空デシケーターを使用して削除されます。
PDMSコーティングおよび硬化
- 泡のないPDMSの溶液を徐々に気泡がディスペンシング工程中に生成されていないことを確認してSU - 8マスター上に分配される。
- 書き込みの透明フィルムの一端は、ホットプレートの上に置き、ゆっくりと均等にSU - 8マスターにPDMSを広めるためにPDMSのソリューションに配置されます。このプロセス中に生成される気泡は、プローブを使用して削除する必要があります。
[注：複数の気泡の発生を防ぐために透明性を持ち上げないでください。] - borofloatのスラブは、均一な圧力を適用する透明シートの上に配置されます。穏やかな圧力は、透明性と円形のSU - 8表面の間に挟まれた、最小限、あるいはまったくPDMSがあるような背の高い円形の構造物の上面（チャネル長の中間に位置し、チャネルの幅に沿って中央）に適用されます。構造。
- さらに3つのborofloatのスラブは、前に円形の開口部の構造物の上面にし、硬化プロセスの間に一定の圧力を適用するには、シリコンウエハーborofloatスラブサンドイッチの上に配置されます。
- ホットプレートの温度は、75に増加して℃、PDMSは、1時間この温度で硬化させる。ホットプレートを50℃の温度にしています
- スラブが削除され、透明性を穏やかにマスターし、その上にコーティングされた薄いPDMSシートを残して削除されます。
マイクロ流体デバイスの構築
マスターからのPDMSシートの除去
- 灌流チャンバーの外側の境界は、SU - 8マスター上のポートと灌流チャンバーにポートを合わせて後にカミソリの刃を使用して、PDMSシートに出刻まれています。
- PDMSシートは、ゆっくりとPDMSの引き裂き防止するためのチャネルの長さに沿って引っ張って、マスターから削除されます。 PDMSシートは上向きに微小流体ネットワークの面を持つ透明シート上に配置されます。
- 入口および出口ポートは、コルクボーラーを用いて作られています。
ガラスカバースリップにPDMSシートの接着
- PDMSシート（表面はマイクロ流体ネットワークを含む）、ガラスのカバースリップの接合面は、その後、静かに透明のシートに配置、3Mのスコッチテープを使用して洗浄し、最後にO 2プラズマチャンバ内に配置されます。
- 接合面は10秒165ワットのプラズマで処理されていますガラスのカバースリップのプラズマ処理表面はすぐにPDMSシートのプラズマ処理表面に接着されている。
注意：接着面の間に閉じ込められた気泡を除去するためにガラスの表面に穏やかな圧力を与える。 - 5分PDMSとガラスの間に良好な接合を得ることができます。 5分後に軽くPDMSシートを接合プロセスのために置かれた透明性を取り除く。
- マイクロ流体デバイスは、チャネルは親水性にするための酸素プラズマシステムに配置されます。プラズマ処理は、1分間165ワットで行われます。
マイクロ流体デバイスと灌流チャンバーの統合
灌流チャンバーの準備
- 既製の灌流チャンバーを命じられた、と入口と出口ポートが結合しているときにマイクロ流体デバイスとチャンバー、チャンバーと、デバイス上のポートが整列されるように掘削された。灌流チャンバーの底面は、Pが塗布されているDMS室とマイクロ流体デバイス間の密封度を得るために。
- 書き込み上の透明シートは、室温でホットプレート上に置かれる。
- 一グラムPDMSのソリューションは、前述と同様のプロセスで調製される。泡のないPDMSの溶液は、次いで徐々に気泡の発生を回避透明シート上に分配される。
- 灌流チャンバーは、PDMSのソリューションに配置されます。
- borofloatのスラブは、均一な圧力を適用すると、チャンバーの底面にPDMSの薄いコーティングを得るためにチャンバーの上部に配置されます。
- ホットプレートの温度は、75に増加して℃、PDMSは、1時間この温度で硬化させる。
マイクロ流体デバイスと灌流チャンバーの接合
- スラブが削除され、透明性を穏やかに灌流チャンバーと、その底部の表面にコーティングされた薄いPDMSシートを残して削除されます。不要なPDMSは、アクセスポートからPDMSの除去のためのカミソリの刃と鋭い先端のプローブを用いて除去される。
- マイクロ流体デバイスのPDMS表面とチャンバーのPDMSの底面は、静かに、3Mテープを使用してきれいに透明のシートに配置し、最後に酸素プラズマチャンバ内に配置されます。
- 表面は10秒165ワットのプラズマで処理されていますチャンバーのPDMSコーティングされた表面は、すぐにマイクロ流体デバイスのPDMSの表面に接着されている。
注意：接着面の間に閉じ込められた気泡を除去するためにガラスの表面に穏やかな圧力を与える。 - 使用直前に、デバイスは、チャネルが親水性にするための酸素プラズマシステムに配置されます。プラズマ処理は、1分間165ワットで行われます。
マイクロ流体デバイスを用いた神経化学的微小環境に脳スライスを公開
- （マイクロ流体デバイス）の親水性マイクロチャネル - （灌流チャンバー）の組み合わせが標準ACSF（人工脳脊髄液）溶液を充填されます。
- 入口ポートでACSF液の小滴を分注し、ソリューションは、最大のチャネルに邪悪になることができます。出口ポートからシリンジを使用して残った気泡を取り除きます。口からマイクロ流体デバイスの出口ポートへの流体の受動的なポンピングを可能に出口ポートでACSF液の大粒を分注する。
注意：注意はパッシブポンピング法を用いた流体の流れを可能にするためにチャネルからすべての気泡を除去するために取られるべきである。 - プレーンプラットフォームの（灌流チャンバー）コンボと顕微鏡アダプタにプレーンプラットフォームを修正 - （マイクロ流体デバイス）を修正しました。
- 標準の入口と出口（吸引）標準ACSF液と脳スライスの連続的な灌流のための灌流チャンバーへの配管を接続します。 ACSF液を連続して95％O2 - 5％CO 2で吸引される。
注：灌流チャンバーの槽内のACSFの一定レベルを維持するために、吸引チューブの位置を調整します。 - 灌流チャンバーはACSF液で満たされると、スポイトを使用して灌流チャンバ内の脳のスライスを配置します。プローブを使用して、マイクロ流体デバイスの円形の開口部の上に脳スライスを配置します。脳のスライスが円形の開口部の所望の位置になると、脳のスライスを固定化するスライスのアンカーを使用してください。
- マイクロ流体デバイスは、現在、流体のポンピングパッシブを使用して様々な神経伝達物質に脳スライスを（灌流チャンバー内およびマイクロ流体ネットワークの上に置かれた）公開するために使用することができます。
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Discussion
既存のマクロスケールやマイクロスケールの脳スライスの灌流チャンバーは、それらが神経伝達物質で脳のスライスを公開するために提供する空間分解能の点で制限されています。ここに示したマイクロ流体デバイス技術は、簡単なバイオMEMS技術を使ってこの制限を克服しています。それは、マイクロ流体デバイスの製作と、既存の電気生理学的セットアップと統合の容易さのシンプルさが実証デバイス技術の広範な応用を可能にすることが予想されます。以前は不可能だった興味深い実験は、現在のマイクロ流体デバイスで実行することができます。脳スライスの異なる微小環境は、異なる時間スケールで異なる神経伝達物質に暴露することができる。現在のプロトタイプのデバイスは、互いに隣に位置する4つだけ並列チャネルと円形の開口部で構成されています。しかし、このデバイスのレイアウトを簡単にさまざまな形状や大きさの開口部を持っているという別のデザインを実装することによって変更することができます、またはマイクロチャネルは、脳スライスの異なる微小環境における開口部の配置につながる形で蛇行することができます。
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Disclosures
著者は生物学の様々な分野への実証マイクロ流体技術に関する共同研究に開放されています。
Acknowledgments
資金は、NIH MH - 64611とNARSAD若手研究者賞によって提供されていました。また、作者は彼らの技術支援のためにアダムビーグリー、マークDikopf、とベンスミスに感謝します。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
