Summary
우리는 서로 다른 신경 전달 물질로 잘 제어 방식으로 뇌 슬라이스의 microscale 표면 노출 표준 전기 생리학의 설정과 통합되는 간단한 microfluidic 장치의 제조를 보여줍니다.
Abstract
우리는 쉽게 기존의 전기 생리학의 설정과 통합 수있는 두 수준 microfluidic 장치의 제조를 증명하고있다. 두 수준 microfluidic 장치는 두 단계 표준 리소그래피 프로세스 1 저항 부정을 사용하는 조작이다. 첫 번째 수준은 각 끝에 유입 및 배출구 포트 microchannels가 포함되어 있습니다. 두 번째 수준은 채널 길이의 중간에 위치하고 채널 폭과 함께 중심으로 microscale 원형 구멍을 포함하고 있습니다. 수동 펌프 방법은 입구 포트에서 배출구 포트 2 유체를 펌프하는 데 사용됩니다. microfluidic 장치는 재고품 재관류의 챔버와 통합 및 전기 생리학 설정과 완벽한 통합이 가능합니다. 유체의 출구 포트를 향해 microchannels를 통해 유입 포트 흐름에 도입하고 또한 재관류의 목욕탕에 microchannels 상단에있는 원형 구멍을 통해 탈출. 따라서 재관류 챔버 목욕과 microfluidic 장치 위에 위치 뇌 슬라이스의 바닥 표면은 서로 다른 신경 전달 물질과 함께 노출 수 있습니다. microfluidic 장치의 microscale 두께와 소재의 투명한 자연 [유리 coverslip와 PDMS (polydimethylsiloxane)] microfluidic 장치가 뇌 슬라이스의 현미경을 허용하기 위해 사용됩니다. microfluidic 장치는 뇌의 슬라이스 microenvironments 소개 화학 자극의 변조 (공간과 시간적 모두) 수 있습니다.
Protocol
SU - 8 몰드 제작
석사 준비
- 실리콘 웨이퍼 기판에 SU - 8 주인이 두 단계 표준 부정적인 저항 리소그래피 공정을 사용하여 준비가되어 있습니다.
- 실리콘 웨이퍼의 정렬 마크 이러한 구조의 높이로 면도날을 사용하여 제거하면 (웨이퍼의 바깥 주변을 따라 위치) 실제 장치 구조 이상입니다.
- 실리콘 웨이퍼는 다음 이소 프로필 알코올을 사용하여 청소 및 N 2의 스트림에 건조합니다. 적은 가장 높은 장치 구조보다 두께 테이프로 만들어 지원 기둥은 웨이퍼의 사면에 정렬 마크를 대체합니다.
참고 : 지원 기둥의 높이가 가장 높은 장치 구조보다 더 많은 경우를 통해 구멍이 PDMS 몰드를 형성하지 않습니다. - 마스터 실리콘 웨이퍼는 실온에서 뜨거운 접시에 배치됩니다.
PDMS 솔루션 준비
- polydimethylsiloxane (PDMS) 솔루션의 네 그램은 철저히 치료 요원 1 일부로 실리콘 탄성체의 10 부분을 혼합하여 준비가되어 있습니다.
참고 : 두 솔루션은 PDMS 금형에 걸쳐 유사한 물리적 성질을 얻기 위해 균일하게 혼합되어 있는지 확인합니다. - 혼합 과정에서 PDMS 솔루션에서 생성된 거품은 진공 건조기를 사용하여 제거됩니다.
PDMS 코팅 및 경화
- 거품없는 PDMS 솔루션은 서서히 거품이 분배 과정에서 생성되지 않도록하는 SU - 8 마스터에 적절합니다.
- 쓰기에서 투명 필름의 한쪽 끝을 그 다음 철판에 위치하고 천천히 고르게 SU - 8 마스터에 PDMS를 확산하기 위해 PDMS 솔루션에 배치됩니다. 이 과정에서 생성된 모든 거품이 프로브를 사용하여 제거해야합니다.
[참고 : 자세한 거품의 생성을 방지하기 위해 투명성을 들지 마십시오.] - borofloat의 슬래브는 균일한 압력을 적용하기 위해 투명 시트의 상단에 위치합니다. 젠틀 압력은 투명성과 원형의 SU - 8 표면 사이에 끼워 넣으면 최소한의 또는 전혀 PDMS가 그러한 높은 원형 구조의 상단 표면 (채널 길이의 중간에 위치하고 채널의 넓이를 따라 중심으로)에 적용 구조.
- 세 이상 borofloat의 슬라브는 전에 원형 개방 구조의 상단 표면에와 치료 과정에서 지속적인 압력을 적용하기 위해 실리콘 웨이퍼 borofloat 슬래브 샌드위치 상단에 표시됩니다.
- 뜨거운 접시의 온도가 다음 75 증가 ° C와 PDMS는 1 시간 동안이 온도에서 치료됩니다. 핫 플레이트 50 ° C.의 온도를 데려
- 슬라브이 제거되고 투명도가 부드럽게 마스터 및 그것의 위에 코팅된 얇은 PDMS 시트 남겨두고 제거됩니다.
microfluidic 장치의 건설
마스터에서 PDMS 시트 제거
- 재관류 챔버의 외부 경계는 SU - 8 마스터에있는 포트와 재관류 챔버에있는 포트를 정렬 후 면도날을 사용하여 PDMS 시트에 나가 새겨져있다.
- PDMS 시트는 부드럽게 PDMS의 찢어 방지하기 위해 채널의 길이를 따라 당기, 마스터에서 제거됩니다. PDMS 시트가 위쪽을 향하고 microfluidic 네트워크 표면을 가진 투명 시트에 배치됩니다.
- 입구와 출구 포트는 다음 코크 송곳을 사용하여 만들어집니다.
유리 coverslip에 PDMS 시트의 결합
- PDMS 시트 (표면이 microfluidic 네트워크를 포함) 및 유리 coverslip의 결합 표면은 부드럽게 투명성의 시트에 배치, 3M의 스카치 테이프를 사용하여 세척하고, 마지막으로 O 2 플라즈마 챔버에 배치됩니다.
- 접착 표면 10 S.위한 165 왓츠 플라즈마로 처리됩니다 유리 coverslip의 플라즈마 표면 처리는 즉시 PDMS 시트의 플라즈마 표면 처리 접착됩니다.
참고 : 결합 표면 사이에 갇혀있는 공기 방울을 제거하기 위해 유리 표면에 부드러운 압력을 적용합니다. - 5 분 PDMS와 유리 사이 좋은 결합을 얻을 수 있습니다. 5 분 후에 부드럽게 PDMS 시트가 결합 프로세스에 삽입되었던에 대한 투명성을 제거합니다.
- microfluidic 장치는 채널이 친수성 만들기 위해 산소 플라즈마 시스템에 배치됩니다. 플라즈마 처리는 1 분 165 왓츠에서 이루어집니다.
microfluidic 장치 및 재관류 챔버의 통합
재관류 챔버의 준비
- 재고품의 재관류 챔버가 주문되었고, 입구와 콘센트 포트 microfluidic 장치와 챔버가 보세 때, 챔버에있는 포트와 장치가 정렬되도록 뚫고 있었다. 재관류 챔버의 바닥 표면은 P로 코팅되어DMS 챔버와 microfluidic 장치 사이에 긴밀한 인감을 얻을 수 있습니다.
- 쓰기에 투명 시트는 실온에서 뜨거운 접시에 배치됩니다.
- 한 g PDMS 솔루션은 앞에서 설명한 것과 유사한 과정에 준비가되어 있습니다. 거품없는 PDMS 솔루션은 다음 천천히 거품의 투명 시트 피하 세대에 적절합니다.
- 재관류 챔버는 다음 PDMS 솔루션에 배치됩니다.
- borofloat의 슬래브는 다음 균일한 압력을 적용하고 챔버의 바닥 표면에 PDMS의 얇은 코팅을 얻기 위해 챔버의 상단에 위치합니다.
- 뜨거운 접시의 온도가 다음 75 증가 ° C와 PDMS는 1 시간 동안이 온도에서 치료됩니다.
microfluidic 장치 및 재관류 챔버의 결합
- 슬래브가 제거되고 투명성이 부드럽게은 아래쪽 표면에 재관류 챔버와 얇은 PDMS 시트 코팅 남겨두고 제거됩니다. 원치 않는 PDMS는 면도날 및 액세스 포트에서 PDMS 제거에 대한 날카로운 팁 프로브를 사용하여 제거됩니다.
- microfluidic 장치와 챔버의 PDMS 바닥 표면의 PDMS의 표면은 부드럽게, 3M 테이프를 사용하여 청소 투명성의 시트에 배치하고, 마지막으로 산소 플라즈마 챔버에 배치됩니다.
- 표면 10 S.위한 165 왓츠 플라즈마로 처리됩니다 챔버의 PDMS 코팅 표면은 즉시 microfluidic 장치의 PDMS의 표면에 접착됩니다.
참고 : 결합 표면 사이에 갇혀있는 공기 방울을 제거하기 위해 유리 표면에 부드러운 압력을 적용합니다. - 즉시 사용하기 전에 장치가 채널이 친수성 만들기 위해 산소 플라즈마 시스템에 배치됩니다. 플라즈마 처리는 1 분 165 왓츠에서 이루어집니다.
microfluidic 장치를 사용 neurochemical microenvironment 두뇌 조각 노출
- (microfluidic 장치)의 친수성 microchannels - (재관류 챔버)을 조합 표준 ACSF (인공 대뇌 척수) 솔루션으로 가득합니다.
- 입구 포트에 ACSF 솔루션의 작은 방울을 분배하고 솔루션은 최대 채널로 악인 될 수 있습니다. 콘센트 포트에서 주사기를 사용하여 남아있는 거품을 제거합니다. 입구에서 microfluidic 장치의 출구 포트에 유체의 수동 펌프 수 있도록 콘센트 포트에서 ACSF 솔루션의 큰 방울을 분배.
참고 : 관리가 수동 펌프 방식을 사용하여 유체의 흐름을 허용하는 채널에서 모든 거품을 제거로 이동해야합니다. - (microfluidic 장치) 수정 - (재관류 챔버) 일반 플랫폼에서 콤보를하고 현미경 어댑터에 일반 플랫폼을 수정.
- 표준 입구와 콘센트 (흡입) 표준 ACSF 솔루션으로 뇌 슬라이스의 지속적인 재관류에 대한 재관류 챔버에 튜브를 연결합니다. ACSF 솔루션은 지속적으로 95% O2 - 5% CO 2 aspirated입니다.
참고 : 재관류 챔버의 욕조에서 ACSF의 일정한 수준을 유지하기 위해 흡입 튜브의 위치를 조정합니다. - 재관류 챔버가 ACSF 솔루션으로 가득되면, 스포이트를 사용하여 재관류 챔버의 뇌 조각을 놓으십시오. 프로브를 사용 microfluidic 장치에 원형의 구멍 위에 뇌 조각의 위치. 두뇌 슬라이스가 원형 구멍을 통해 원하는 위치에되면, 뇌의 슬라이스를 무력화하기 위해 슬라이스 앵커를 사용합니다.
- microfluidic 장치가 지금은 유체의 펌핑 패시브를 사용하여 다양한 신경 전달 물질로 두뇌 조각 (재관류 챔버와 microfluidic 네트워크의 상단에 위치) 노출하는 데 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
기존 macroscale 또는 microscale 두뇌 슬라이스 재관류 챔버스들은 신경 전달 물질로 뇌 조각을 폭로 제공하는 공간 해상도 측면에서 한계가 있습니다. 여기 시연 microfluidic 장치 기술은 간단한 bioMEMS 기법을 사용하여이 제한을 극복. 그것은 microfluidic 장치의 제조 및 기존 전기 생리학의 설정과 통합의 용이성에 단순이 증명 장치 기술의 광범위한 응용 프로그램을 만들 것이라는 것을 예상합니다. 불가능되지 않은 흥미로운 실험 이전에 현재 microfluidic 장치를 수행할 수 있습니다. 뇌 슬라이스의 다른 microenvironments 서로 다른 시간 스케일에서 서로 다른 신경 전달 물질에 노출 될 수 있습니다. 현재 프로토 타입 장치는 서로 옆에있는 명만 병렬 채널과 원형 개구부로 구성되어 있습니다. 그러나,이 장치 레이아웃 쉽게 다양한 모양이나 크기 또는 microchannels의 구멍이 뇌 조각의 다른 microenvironments에있는 구멍의 위치로 이어질 수있는 방식으로 meandered 수 있습니다했을 서로 다른 디자인을 구현하여 변경할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 생물학의 다른 분야에 대한 시연 microfluidic 기술을 포함한 협력 열려 있습니다.
Acknowledgments
기금은 NIH MH - 64611와 NARSAD 젊은 탐정 수상에 의해 제공되었다. 저자는 또한 기술 지원 아담 비글리, 마크 Dikopf, 그리고 벤 스미스 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RC-26GPL | Tool | Warner Instruments | W2-64-0236 | Low Profile Large Bath RC-26GLP Recording Chamber |
| SHD-26GH/10 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0253 | Stainless steel slice hold-down for RC-26G, 1.0 mm thread spacing |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 | Silicone Elastomer Kit |
| Plasma Preen-II 862 | Tool | Plasmatic Systems, Inc. | Microwave plasma system | |
| Model P-1 | Tool | Warner Instruments | W2-64-0277 | Series 20 Plain Platform, Model P-1 |
| SA-NIK | Tool | Warner Instruments | W2-64-0291 | Adapter for Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK |
| Oxygenated, heated ACSF (Artificial cerebro-spinal fluid) | Reagent | Exact composition will vary with application |
References
- Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment. Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).
- Walker, G. M., Beebe, D. J. A passive pumping method for microfluidic devices. Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).
