Summary
Cet article décrit une méthode pour obtenir un en trois dimensions (3D) la structure des molécules hélice assemblés par cryo-microscopie électronique. Dans ce protocole, nous utilisons assemblées VIH-1 capside pour illustrer la procédure de reconstruction 3D détaillée pour réaliser une carte de densité par la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale espace réel.
Abstract
Cryo-microscopie électronique (cryo-EM), combiné avec le traitement d'image, est un outil puissant pour la détermination de la structure des complexes de protéines et des assemblages macromoléculaires. En fait, seule la microscopie électronique de particules 1 et à deux dimensions (2D) cristallographie électronique 2 sont devenus des méthodologies relativement courantes et un grand nombre de structures ont été résolus en utilisant ces méthodes. Dans le même temps, le traitement d'image et en trois dimensions (3D) la reconstruction d'objets hélicoïdale s'est rapidement développée, en particulier, l'itératif hélicoïdale espace réel de reconstruction (IHRSR) la méthode 3, qui utilise des outils simples d'analyse des particules en conjonction avec une symétrie hélicoïdale. De nombreuses entités biologiques fonction dans les formes filamenteuses ou hélicoïdale, dont les filaments d'actine 4, 5 microtubules, fibres amyloïdes 6, 7 virus mosaïque du tabac, et les flagelles des bactéries 8, et, parce que une carte de densité d'une entité 3D hélicoïdale peut être atteint par une seule projection l'image, par rapport aux images de nombreux nécessaires pour la reconstruction 3D d'un objet non hélicoïdales, avec la méthode IHRSR, analyse structurale de ces assemblages flexibles et désordonnés hélicoïdale est maintenant réalisable.
Dans cet article, vidéo, nous fournissons des protocoles détaillés pour l'obtention d'une carte de densité 3D d'un assemblage de protéines hélicoïdales (VIH-1 capside 9 est notre exemple), y compris des protocoles pour la préparation des échantillons cryo-EM, faible dose de collecte de données par cryo-EM, l'indexation des figures de diffraction hélicoïdale et le traitement d'image et de la reconstruction 3D utilisant IHRSR. Comparé à d'autres techniques, la cryo-EM offre conservation des spécimens optimale dans des conditions proches des conditions natives. Les échantillons sont noyées dans une couche mince de glace vitreuse, par congélation rapide, et imagée dans les microscopes électroniques à la température de l'azote liquide, dans des conditions à faible dose pour minimiser les dégâts d'irradiation. Exemples d'images sont obtenues dans des conditions quasi native aux dépens des signaux faibles et faible contraste dans les micrographies enregistrées. Heureusement, le processus de reconstruction hélicoïdale a été largement automatisée, à l'exception de l'indexation du spectre de diffraction hélicoïdale. Ici, nous décrivons une approche à l'index structure hélicoïdale et de déterminer les symétries hélicoïdale (paramètres hélicoïdaux) de micrographies numérisés, une étape essentielle pour la 3D hélicoïdale de reconstruction. Brièvement, on obtient une carte de la densité initiale de 3D en appliquant la méthode IHRSR. Cette carte initiale est ensuite itérativement affiné par l'introduction de contraintes pour les paramètres d'alignement de chaque segment, de manière à contrôler leurs degrés de liberté. Une nouvelle amélioration est obtenue en corrigeant pour la fonction de transfert de contraste (FCE) du microscope électronique (correction d'amplitude et phase) et en optimisant la symétrie hélicoïdale de l'assemblée.
Protocol
1. Frozen-hydraté préparation des échantillons EM
Parce que le VIH-1 protéine de capside (CA) sont stables assemblées 9 seulement en sel (NaCl 1M) tampon, ce qui contribue le bruit de fond fort dans la cryo-EM images, nous utilisons une dilution rapide et retour côte méthode de buvard pour transitoirement réduire le sel la concentration lors de la préparation de la grille congelés-hydratés EM.
- Décharge luminescente côté de carbone de 200 mailles R2 / 1 des grilles de cuivre Quantifoil sous 25mA pendant 25 secondes.
- Utilisez un nébuliseur pour amener le taux d'humidité dans la chambre de l'environnement, un home-made plongeur gravité manuel, à 80%.
- Dans le dewar FEI Vitrobot piston, cool éthane liquide en utilisant l'azote liquide. Montez le dewar plongent au point de congélation sur le plongeur gravité manuel.
- Appliquer 2,5 ul de la solution CA prémonté sur le côté de la grille de carbone, qui est monté sur une pince, et de la charge de la pince sur le piston avec le côté de carbone de la grille face à vous.
- Ajouter 3 pi de tampon de sel faible dilution (100 mM NaCl) à l'arrière de la grille et immédiatement éponger la face arrière de la grille avec un morceau de papier filtre. La surface arrière ensemble de la grille doit être en contact étroit avec le papier filtre pendant environ 6 secondes, avant de retirer le papier filtre. Plonger immédiatement dans la grille de l'éthane liquide après avoir retiré le papier filtre.
- Retirer les pinces du piston et de transférer rapidement de la grille dans une boîte de stockage réseau.
2. Cryo-microscopie électronique de CA assemblages tubulaires
- Chargez la grille congelés-hydraté dans une exploitation FEI Polara G2 microscope électronique à 200kV et équipé d'une caméra CCD Gatan 4Kx4K.
- Dans le mode à faible dose à la recherche, à un grossissement de 200x ~ et avec une dose <0.001e - / A 2, l'écran toute la grille pour les zones de glace convenable et enregistrer les positions de ces domaines dans un fichier de scène.
- Rappel des positions enregistrées et l'écran davantage ces domaines à un grossissement de x 3900 en mode de faible dose de recherche. Sélectionnez les zones avec un uniforme, mince couche de glace contenant bien séparées, de longs tubes sur les trous, pour la collecte des données. Enregistrer les emplacements de ces zones dans un fichier de la deuxième étape.
- Passer en mode d'exposition à un grossissement de 59 000 x 100 en médaillon une ouverture de l'objectif um, et ajuster la stigmatisation objectif et l'intensité du faisceau pour une dose de ~ 15 e - / A 2 par l'exposition.
- Retour au mode de faibles doses de recherche, passer à une position enregistrée et d'identifier et d'un centre à l'aide d'un tube de bons de la caméra CCD. Passez en mode mise au point, d'ajuster le focus, et définir une valeur défocalisation, normalement entre 0,5 à 2,5 um. Basculer vers le mode d'exposition, mis un temps d'exposition de 0,3-0,5 secondes, pour une dose de 15 e - / A 2, et de recueillir une image. Les images sont recueillies sur un appareil à plaques, et les films devraient être autorisés à s'installer pendant 10 secondes avant une exposition est prise.
- Déplacement à la position suivante sauvés et répétez l'étape 5 pour recueillir plus d'images.
- Les films sont développés en pleine force D19 pendant 12 minutes et numérisées en utilisant un Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner à une taille de pixel de 6,35 um. Le format des fichiers d'image est TIFF.
3. Indexation hélicoïdal
Un objet hélicoïdale peut être indexé par deux paramètres: l'ordre de Bessel, n, et le numéro de ligne de la couche, L. Chaque ligne du calque dans la transformée de Fourier, qui se caractérise par (n, l), correspond à un ensemble de lignes sur le réseau de surface de l'objet dénoté par hélicoïdale (h, k) des indices, en utilisant la notation d'un treillis 2D. Pour tout (h, k), une ligne de couche (n hk, l hk) est une combinaison linéaire de deux vecteurs de base (n 10, L 10) et (n 01, L 01), qui sont les valeurs de n et l les deux lignes principales couches (1, 0) et (0, 1). L peut être obtenu à partir de la hauteur de ligne couche mesurée selon l'axe Z dans la transformée de Fourier. La valeur de n peut être estimée en utilisant l'équation suivante 10
πRr ≈ J n ≈ 1,1 | n | -0,9 .....................( 1)
où J n est la fonction de Bessel, qui détermine l'intensité de la ligne n ème couche, r est le rayon de l'objet hélicoïdale, et R est le rayon de l'amplitude maximale de la ligne de couche. Le numéro de ligne couche, l, est lié à n par la règle 11 sélection
l = tn + euh ....................( 2)
où t et u sont des constantes de l'hélice. Pour toute hélice donné, il peut y avoir des unités exactement u exactement (ou très près) t cOMPLÈTE tours.
- Boîte à un tube relativement droit et long avec un diamètre uniforme en utilisant le programme du RESE 12 helixboxer et enregistrer l'image au format de la MRC.
- Déterminer la distance de répétition hélicoïdale, c, en utilisant un programme de corrélation croisée basée, comme «imgccf», dans le paquet MRC 13.
- Calculer la transformée de Fourier avec une longueur de nouvelle boîte qui est une intégrale de la distance de répétition, c.
- Choisissez deux lignes principales couche de base qui définissent deux vecteurs en treillis de surface (1,0) et (0,1).
- Mesurer le rayon du tube, r, et la hauteur et le rayon des deux lignes de la couche principale de la transformée de Fourier, L 10, R 10, R 01 L 01, respectivement (Fig. 1).
- Calculer N 10 et N 01 selon l'équation (1).
- Depuis n valeurs ne sont que l'estimation, quelques combinaisons de N 10 et N 01 sont testés dans les étapes ultérieures (voir l'étape 4.2) afin de trouver la symétrie hélicoïdale correcte en utilisant l'emballage IHRSR programme.
- Calculer la symétrie vis décrite par deux nombres réels: la rotation entre les sous-unités (Δφ) et la montée axiale (Az) de l'hélice une étoile (n = 1). Compte tenu de l 10, L 01, n 10, 01 et n valeurs, u et t peuvent être obtenus en testant une série de valeurs m (par exemple, -50 <m <50) selon la règle de sélection. Enfin, Δφ et Az sont calculées en utilisant Δφ = 360 t / u et Az = c / u.
4. Reconstruction tridimensionnelle
- La segmentation des particules
- Ouvrez une micrographie contenant des particules hélicoïdales, en utilisant le Boxer programme graphique, qui est un programme dans le paquet du RESE.
- Couper la particule hélicoïdale en segments qui se chevauchent. Dans le panneau de contrôle de Boxer, choisissez le mode Helix et définir les paramètres pour la boxe: la taille de la boîte doit être plus grand que le diamètre de la particule et la valeur pour 'Olap "doit être ~ 90% de la taille de la boîte.
- Après un clic gauche sur chaque extrémité de la particule hélicoïdale, Boxer va générer automatiquement une série de boîtes de particules le long d'hélice.
- Enregistrer les segments encadrés ainsi que leurs coordonnées.
- Initial de reconstruction 3D en utilisant des programmes IHRSR
- Inverser le contraste des images cryo-EM et appliquer filtrage passe-bas 14 (en option) avant de traiter avec la méthode itérative de reconstruction hélicoïdale espace réel (IHRSR).
- Ouvrez l'interface graphique du programme IHRSR en tapant «générateur». Fournir de l'interface graphique avec toutes les informations pour la pile en boîte particules, y compris le nom et le chemin de la pile, le nombre d'images dans la pile, les valeurs pour les paramètres de la symétrie, etc Cliquez sur le bouton «Finish» pour créer le script de reconstruction, b25.spi.
- Utiliser un cylindre plein ou creux comme une référence initiale et permettre à la procédure au cycle jusqu'à ce qu'il n'y a aucun changement dans la symétrie vis définis, qui survient généralement après quelques cycles. Une symétrie droite hélicoïdale doit donner une reconstruction stable convergé. La reconstruction généré lors du dernier cycle sera utilisée comme une référence initiale pour affiner davantage. IHRSR effectue la reconstruction 3D en utilisant des programmes SPIDER.
- Reconstruction avec raffinement itératif 15 La reconstruction 3D générés par IHRSR est maintenant utilisée comme une référence initiale de raffinement supplémentaire. Pendant le raffinement, la symétrie hélicoïdale est fixée à Δφ et Az, qui sont déterminés à partir de la procédure IHRSR.
- Déterminer la défocalisation et de présenter l'astigmatisme sur la micrographie et de l'utilisation de programmes CTFFIND3 CTFTILT 16.
- Multipliez les segments de particules par le FCT en utilisant des programmes SPIDER 17. L'opération dite FT dans la suite de SPIDER est utilisée pour calculer la transformée de Fourier (FFT) de l'image 2D. Par la suite, la FFT est multiplié par les valeurs du FCT, déterminée dans les étapes précédentes, en utilisant l'opération appelée MU dans la suite SPIDER. La valeur obtenue est ensuite transformée inverse arrière pour former une nouvelle image (CTF-corrigé) dans l'espace réel en utilisant l'opération SPIDER, FT nouveau.
- Effectuer correspondant de projection en comparant les prévisions des volumes de référence avec le FCT-corrigées des images, en utilisant l'alignement de référence multi-. La variation de l'angle d'inclinaison out-of-avion est limité à + / -10 ° et échantillonnés dans les étapes 1 °. Introduire des contraintes, telles que les coefficients de corrélation élevés, dans le plan angles proche de 0 ° ou 180 ° et limités x-quarts, pour les paramètres d'alignement de chaque segment. Inclure dans la reconstruction uniquement les segments qui satisfont les contraintes.
- Après chaque cycle itératif de raffinement, une reconstruction 3D est généré en utilisant la projection arrière et divisée par la somme sur le CTF2.
- Imposer la symétrie hélicoïdale de générer un volume symétrisée. Le raffinement itératif est terminé lorsque aucune amélioration dans la résolution de la reconstruction 3D nouvelle survient.
- Le SPIDER forfait de traitement d'image est utilisé pour la plupart des étapes de raffinement. Une série d'opérations sont contrôlées par des scripts SPIDER, qui sont créés par l'utilisateur des fichiers de contrôle des lots contenant des séquences d'opérations et les valeurs des paramètres. La reconstruction finale est calculée en utilisant des programmes dans SPIDER suite.
5. Les résultats représentatifs:
Un seul VIH-1 CA A92E tube (Fig. 1a) était hors boîte et sa transformée de Fourier (Fig. 1b) a été calculée pour l'indexation hélicoïdale. Pour les lignes de la couche (1, 0) et (0, 1), L 10 = 28, L 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Etant donné un rayon de tube de 211.57Å, nous approchée n 10 =- 12, n 01 = 11 (ici, l'impartialité a été prédéterminée). Avec une distance de répétition de 5195.48Å, la symétrie à vis du tube a été déterminée comme Az = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Az et Δφ ont été raffinés pour 7.1321Å et 328,86 ° en utilisant IHRSR (fig. 2a) et la reconstruction initiale est montré dans la Fig. 2b. La reconstruction finale (fig. 3), après affinage itératif, l'amélioration de la carte de densité de façon significative à partir du modèle initial calculé par IHRSR (fig. 2b).
Figure 1. Indexation du VIH-1 CA hélicoïdaux tube. (A) Une seule image de VIH-1 tube de CA A92E. La barre d'échelle, de 30 nm. (B) La transformée de Fourier du tube représenté en (A). Les indices hélicoïdale (n 10 =- 12, n 01 = 11) sont notés. La flèche pointe vers la ligne à la résolution de la couche 23a.
Figure 2. Une reconstruction initiale à l'aide IHRSR. (A) la détermination de symétrie vis pour chaque cycle itératif. Δφ et Az, à partir des valeurs initiales, convergent vers des valeurs stables après 10 cycles itératifs de raffinement. (B) La carte 3D densité initiale au bout de 10 cycles itératifs.
Figure 3. La carte de densité 3D après le raffinement itératif. (AC) La carte de densité des tubes CA est affiché comme trois tranches orthogonales: parallèlement à l'axe du tube et proche de la surface (A), perpendiculaire à l'axe du tube (B), et parallèlement à et à travers l'axe du tube (C) . Barres d'échelle, de 10 nm. (D) le rendu de surface de la carte de densité 3D profilée à 1,8 s enfermer un volume de 100%.
Discussion
Nous présentons un ensemble de protocoles pour fournir une approche simple pour obtenir des structures 3D d'objets en hélice. En utilisant les procédures décrites, nous avons acquis une structure 3D du VIH-1 assemblage de la capside partir d'une image simple tube (176 segments). Structures à plus haute résolution peut être obtenue en incluant des données d'image de plus.
Il ya plusieurs points critiques pour la collecte des données optimale et d'analyse: d'abord, lors de la préparation d'un échantillon de cryo-EM, la solution de l'échantillon doit être effacé, laissant un uniforme, fine couche de solution qui est légèrement plus épais que la taille de l'échantillon. Il ya plusieurs façons différentes d'effacer l'échantillon. Pour les cellules bactériennes et de spécimens tubulaires, telles que le VIH-1 de l'Assemblée CA, effaçant d'un côté, en particulier de l'arrière-côte, est la plus appropriée.
Deuxièmement, l'impartialité de l'hélice doit être déterminée, car cela ne peut se faire par l'indexation hélicoïdale ou de reconstruction. Une pratique courante est d'utiliser le gel gravure, suivie par l'observation rotative 18 pour déterminer impartialité. Impartialité peut également être déterminée d'après-reconstruction quand la résolution de la carte de la densité est suffisamment élevée; les modèles 3D atomiques des composants individuels devraient s'intègrent bien dans la carte de la densité quand un autoritarisme est supposée correcte. Sinon, l'impartialité inverse devrait être assumée.
Troisièmement, un filtre de Wiener doit être utilisé pendant le traitement d'image, pour les deux phases et de correction d'amplitude, de réduire l'amplification du bruit. Depuis le FCT à partir d'une seule image a toujours des passages par zéro, une partie de l'information dans l'espace réciproque est perdu. Par conséquent, il est nécessaire de disposer de données de projection de multiples jeux inclus pour la reconstruction 3D, chaque imagées à des valeurs différentes défocalisation.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Zhao et Gongpu Danxia Ke pour le soutien technique. Nous remercions les Drs. Edward Egelman et Niko Grigorieff pour partager leur logiciel de traitement d'image. Nous reconnaissons également le personnel qui soutiennent la biologie structurale cryo-EM installations et cluster Beowulf et la grille à l'Université de Pittsburgh de la médecine. Ce travail a été soutenu par GM082251 et GM085043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
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