Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um eine dreidimensionale (3D) Struktur der spiralförmig montiert Moleküle mittels Kryo-Elektronenmikroskopie erhalten. In diesem Protokoll, verwenden wir HIV-1 Capsid Baugruppen für die detaillierte 3D-Rekonstruktion Verfahren zum Erreichen einer Dichte Karte durch die iterative helikale Realraum Rekonstruktion Methode zu illustrieren.
Abstract
Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), mit Bildverarbeitung kombiniert, ist eine zunehmend mächtiges Werkzeug zur Strukturaufklärung von makromolekularen Proteinkomplexen und Baugruppen. In der Tat haben einzelne Partikel Elektronenmikroskopie 1 und zweidimensionale (2D) Elektronenkristallographie 2 haben sich relativ Routine Methoden und eine Vielzahl von Strukturen gelöst mit diesen Methoden. Zur gleichen Zeit hat der Bildverarbeitung und dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Helix-Objekte schnell entwickelt, vor allem, die iterative helikale Realraum Wiederaufbau (IHRSR)-Methode 3, die einzelnen Partikel-Analyse-Tools verwendet in Verbindung mit helikalen Symmetrie. Viele biologische Einheiten Funktion in filamentösen oder spiralförmige Formen, einschließlich Aktinfilamente 4, Mikrotubuli 5, Amyloid-Fasern 6, Tabak-Mosaik-Virus 7 und Bakterien Geißeln 8, und weil ein 3D-Dichte Karte eine spiralförmige Einheit aus einer Projektion erreicht werden kann Bild, im Vergleich zu den vielen Bildern für die 3D-Rekonstruktion eines nichthelikalen Objekt erforderlich, mit dem IHRSR Methode, Strukturanalyse eines solchen flexiblen und ungeordneten spiralförmigen Anordnungen ist nun erreichbar.
In diesem Video-Artikel bieten wir Ihnen detaillierte Protokolle für die Erlangung eines 3D-Dichte Karte eine helikale Protein Montage (HIV-1 Capsid 9 ist unser Beispiel), einschließlich der Protokolle für die Kryo-EM Probenvorbereitung, niedrige Dosis Datenerhebung durch Kryo-EM, Indexierung von Schraubenfedern Beugungsmuster und Bildverarbeitungs-und 3D-Rekonstruktion mit IHRSR. Im Vergleich zu anderen Techniken, bietet Kryo-EM optimale Probe Erhaltung unter nahezu natürlichen Bedingungen. Die Proben werden in einer dünnen Schicht aus glasigem Eis eingebettet, durch schnelles Einfrieren und abgebildet in Elektronenmikroskopen bei der Temperatur flüssigen Stickstoffs, unter niedrig dosiertem Bedingungen, um die Strahlung zu minimieren. Beispielbilder sind unter nahezu natürlichen Bedingungen zu Lasten der Low-Signal und geringem Kontrast in der aufgezeichneten Aufnahmen erhalten. Glücklicherweise hat der Prozess der helikalen Wiederaufbau weitgehend automatisiert, mit Ausnahme der Indizierung der spiralförmigen Beugungsmuster. Hier beschreiben wir einen Ansatz zur Index Helix-Struktur und bestimmen helikale Symmetrie (helikale Parameter) aus digitalisierten Aufnahmen, ein wesentlicher Schritt für die 3D-helikale Wiederaufbau. Kurz gesagt, erhalten wir einen ersten 3D-density map durch die Anwendung der IHRSR Methode. Diese erste Karte wird dann iterativ durch die Einführung von Beschränkungen für die Ausrichtung Parameter der einzelnen Segmente und damit die Kontrolle ihrer Freiheitsgrade verfeinert. Eine weitere Verbesserung ist durch die Korrektur für die contrast transfer function (CTF) des Elektronenmikroskops (Amplitude und Phase-Korrektur) und durch die Optimierung der helikale Symmetrie der Anordnung erreicht.
Protocol
1. Frozen-hydratisiert EM Probenvorbereitung
Da HIV-1 Capsid Protein (CA) Baugruppen 9 nur in hohen Salzkonzentrationen (1M NaCl)-Puffer, der starke Hintergrundgeräusche in Kryo-EM-Bilder beteiligt sind stabil, verwenden wir eine rasche Verdünnung und Rückseite Blot-Methode, um vorübergehend verringern das Salz Konzentration bei der Vorbereitung der gefrorenen hydratisierten EM Gitter.
- Glimmentladung die Kohlenstoff-Seite des 200-mesh R2 / 1 Quantifoil Kupfergittern unter 25mA für 25 Sekunden.
- Verwenden Sie einen Vernebler, die Luftfeuchtigkeit in der Klimakammer, eine hausgemachte manuelle Schwerkraft Kolben, auf 80% zu bringen.
- In der FEI Vitrobot Plunger Dewar, kühlen flüssigem Ethan mit flüssigem Stickstoff. Montieren Sie den Sprung-freezing Dewar auf die manuelle Schwerkraft Kolben.
- Übernehmen 2,5 ul vormontiert CA-Lösung auf den Kohlenstoff Seite des Gitters, die auf einer Pinzette montiert ist, und laden Sie die Zange auf den Kolben mit dem Kohlenstoff Seite des Gitters abgewandten Sie.
- Add 3 ul salzarme Verdünnungspuffer (100 mM NaCl) auf der Rückseite des Gitters und sofort Blot der Rückseite des Gitters mit einem Stück Filterpapier. Die gesamte Rückseite des Gitters sollte in engem Kontakt mit dem Filterpapier für ca. 6 Sekunden, bevor Sie das Filterpapier. Sofort stürzen die Gitter in flüssigem Ethan nach dem Entfernen des Filterpapiers.
- Entfernen Sie die Zange aus dem Kolben und schnelle Übertragung des Gitters in eine Grid-Storage-Box.
2. Cryo-Elektronenmikroskopie von CA röhrenförmigen Baugruppen
- Legen Sie die gefrorenen hydratisierten Gitter in eine FEI Polara G2 Elektronenmikroskop Betrieb bei 200kV und ausgestattet mit einem Gatan 4Kx4K CCD-Kamera.
- Unter low-dose-Suchmodus bei einer Vergrößerung von ~ 200x und mit einer Dosis <0,001 E - / A 2, Bildschirm das gesamte Netz für Gebiete mit geeigneten Eis und speichern Sie die Positionen dieser Bereiche in einer Phase-Datei.
- Rufen Sie die gespeicherten Positionen und weiteren Bildschirm diesen Bereichen bei einer Vergrößerung von 3.900 x in low-dose-Suchmodus. Wählen Sie die Bereiche mit einer gleichmäßigen, dünnen Schicht aus Eis, das gut getrennt, lange Rohre über Löcher, für die Datenerfassung. Speichern Sie die Positionen dieser Bereiche in einer zweiten Stufe Datei.
- Wechseln Sie zu Belichtungssteuerung bei einer Vergrößerung von 59.000 x, Einsatz einer 100 um Objektivöffnung, und passen Sie das Ziel, Stigmatisierung und Strahlintensität für eine Dosis von ~ 15 e - / Å 2 pro Belichtung.
- Zurück zur low-dose-Suchmodus, um eine gespeicherte Position zu verschieben und zu identifizieren und in der Mitte eine gute Röhre mit der CCD-Kamera. Wechseln Sie in den Fokus-Modus, stellen Sie den Fokus, und legen Sie einen defocus Wert, der normalerweise zwischen 0,5 bis 2,5 um. Wechseln Sie in die Belichtungssteuerung, stellen eine Belichtungszeit von 0,3-0,5 Sekunden, für eine Dosis von 15 E - / A 2, und sammeln Sie ein Bild. Die Bilder werden auf einem Teller Kamera gesammelt, und die Filme sollten die Möglichkeit für 10 Sekunden zu begleichen, bevor eine Belichtung aufgenommen wird.
- Gehen Sie zum nächsten gespeicherten Position und wiederholen Sie Schritt 5, um weitere Bilder zu sammeln.
- Die Filme werden in voller Stärke D19 für 12 Minuten entwickelt und digitalisiert mit einem Nikon Super Coolscan 9000 ED Scanner bei einer Pixelgröße von 6,35 um. Das Format der Bilddateien ist TIFF.
3. Helical Indizierung
Eine spiralförmige Objekt kann durch zwei Parameter indiziert werden: Die Bessel Ordnung n, und Schicht Zeilennummer, l. Jede Schicht Linie in der Fourier-Transformation, wie sie aus (n, l), entspricht einer Reihe von Linien auf der Oberfläche Gitter der helikalen Objekt bezeichnet durch (h, k)-Indizes, mit der Notation aus einer 2D-Gitter. Für alle (h, k), ist eine (n hk, l hk) Schicht Linie eine lineare Kombination von zwei Basisvektoren (n = 10, l 10) und (n 01, l 01), die n und l-Werte sind Die beiden wichtigsten Schicht Linien (1, 0) und (0, 1). l kann aus der Schicht line Höhe entlang der Z-Achse in der Fourier-Transformation gemessen bezogen werden. Der Wert von n kann anhand der folgenden Gleichung 10 werden
πRr ≈ J n ≈ 1,1 | n | -0,9 .....................( 1)
wo J n der Bessel-Funktion, die die Intensität der n-ten Schicht Linie bestimmt ist, ist r der Radius der spiralförmigen Objekt, und R ist der Radius der maximalen Amplitude der Schicht Linie. Die Schicht Zeilennummer, l, ist n durch die Auswahl Regel 11 im Zusammenhang
l = tn + um ....................( 2)
wo t und u sind Konstanten der Helix. Für jede gegebene Helix, kann es genau u Einheiten werden in genau (oder sehr nahe) t complete dreht.
- Box aus einer relativ geraden und langen Rohr mit einheitlichem Durchmesser mit dem EMAN ist Programm 12 helixboxer und speichern Sie das Bild in MRC-Format.
- Bestimmen Sie die spiralförmige wiederholen Abstand, c, mit einer Kreuzkorrelation basiertes Programm, wie "imgccf ', in der MRC-Paket 13.
- Berechnen Sie die Fourier-Transformation mit einem neuen Feld Länge, die ein Integral der Wiederholung Abstand, c ist.
- Wählen Sie zwei Haupt-Schicht Linien, die zwei grundlegende Oberfläche Gittervektoren (1,0) zu definieren und (0,1).
- Messen Sie den Radius des Rohres, r, und die Höhe und Radius der beiden wichtigsten Schicht Linien in Fourier-Transformation, l 10, R 10, L 01 R 01 bzw. (Abb. 1).
- Berechnen Sie n 10 und n 01 nach Gleichung (1).
- Da n-Werte nur Schätzungen sind, sind ein paar Kombinationen von n 10 und n 01 in späteren Schritten getestet (siehe Schritt 4.2) auf die richtige helikale Symmetrie mit dem Programmpaket IHRSR finden.
- Berechnen Sie die Schraube Symmetrie von zwei reellen Zahlen beschrieben: die Rotation zwischen den Untereinheiten (Δφ) und die axiale Anstieg (Az) der Ein-Sterne-Helix (n = 1). Angesichts l 10, l 01, n 10 und n 01-Werte, können u und t durch die Prüfung einer Reihe von m-Werte (zum Beispiel, -50 <m <50) nach der Auswahl der Regel erhalten werden. Schließlich sind Δφ und Az berechnet Δφ = 360 t / u und Az = c / u.
4. Dreidimensionale Rekonstruktion
- Particle-Segmentierung
- Öffnen Sie eine Aufnahme mit spiralförmigen Partikel, über die grafische Programm Boxer, der ein Programm in der EMAN Paket ist.
- Cut die spiralförmige Partikel in überlappende Segmente. In der Zentrale der Boxer, wählen Helix-Modus und die Parameter für den Boxsport: die Größe der Box sollte größer sein als der Durchmesser der Teilchen und der Wert für 'Olap "sollte ~ 90% of the box groß sein.
- Nach der linken Maustaste auf den beiden Enden der helikalen Partikel werden Boxer automatisch eine Reihe von Partikel-Boxen entlang der Helix Länge.
- Speichern boxed Segmente sowie deren Koordinaten.
- Erste 3D-Rekonstruktion mit IHRSR Programme
- Invert den Kontrast der Kryo-EM-Bilder und gelten Tiefpassfilterung 14 (optional) vor der Verarbeitung mit dem iterativen helikale realen Raum Rekonstruktionsverfahren (IHRSR).
- Öffnen Sie die grafische Oberfläche von IHRSR Programm durch Eingabe von "Generator". Geben Sie die grafische Oberfläche mit allen Informationen für die boxed Partikel-Stack, einschließlich der Namen und den Pfad des Stapels, Anzahl der Bilder im Stapel, die Werte für die Symmetrie-Parameter, etc. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Fertig stellen", um den Wiederaufbau Skript zu erstellen, b25.spi.
- Verwenden Sie eine feste oder Hohlzylinder als erste Referenz-und erlaubt das Verfahren Zyklus, bis es keine Änderungen in den definierten Schraube Symmetrie, was in der Regel nach wenigen Zyklen sind. Ein Recht helikale Symmetrie sollte eine stabil konvergente Wiederaufbau. Der Wiederaufbau in den letzten Zyklus erzeugt wird, als eine erste Referenz für weitere Verfeinerung verwendet werden. IHRSR führt 3D-Rekonstruktion mit SPIDER-Programme.
- Rekonstruktion mit Nachiteration 15 Die 3D-Rekonstruktion von IHRSR erzeugt wird jetzt als erste Referenz für weitere Verfeinerung verwendet. Während der Weiterbildung ist die helikale Symmetrie bei Δφ und Az, die aus der IHRSR Verfahren bestimmt sind festgelegt.
- Bestimmen Sie die Unschärfe und Astigmatismus in der Aufnahme mit Programmen CTFFIND3 und CTFTILT 16.
- Multiplizieren Partikel Segmente durch die CTF mit SPIDER-Programme 17. Der Betrieb bezeichnet FT in der SPIDER-Suite wird verwendet, um die Fourier-Transformation (FFT) des 2D-Bild zu berechnen. Danach wird die FFT von CTF-Werte multipliziert, ermittelt in den vorherigen Schritten mit der Operation bezeichnet MU innerhalb der SPIDER-Suite. Der erhaltene Wert wird dann inverse wieder ein neues Bild (CTF-korrigiert) im realen Raum mit dem SPIDER Betrieb Form umgewandelt, wieder FT.
- Führen Projektion Matching durch Vergleich Projektionen des Referenz-Volumes mit dem CTF-korrigierten Bilder, mit Multi-Referenz-Ausrichtung. Die Variation in der Out-of-plane Neigungswinkel ist zu + / -10 ° begrenzt und beprobt in 1 °-Schritten. Führen Sie Einschränkungen, z. B. hohe Korrelationskoeffizienten, in-plane Winkel nahe 0 ° oder 180 ° haben und begrenzt x-Schichten, für die Ausrichtung Parameter der einzelnen Segmente. Include in der Rekonstruktion nur jene Segmente, die die Einschränkungen zu befriedigen.
- Nach jedem iterative Verfeinerung Zyklus wird eine 3D-Rekonstruktion unter Verwendung Rückprojektion und durch die Summe geteilt über die CTF2.
- Impose die helikale Symmetrie zu einem symmetrisierten Volumen zu generieren. Die iterative Verfeinerung ist beendet, wenn keine weitere Verbesserung der Auflösung der neuen 3D-Rekonstruktion erfolgt.
- Die Bildverarbeitungs-Paket SPIDER ist für die meisten der Verfeinerung Schritte verwendet. Eine Reihe von Operationen werden von SPIDER-Skripte, die vom Benutzer erstellten Batch-Steuerung Dateien mit Sequenzen von Operationen und Parameter-Werte kontrolliert werden. Die endgültige Rekonstruktion errechnet Programme in SPIDER-Suite.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Eine einzige HIV-1 CA A92E Rohr (Abb. 1a) wurde boxed out und seine Fourier-Transformation (Abb. 1b) wurde für Helix Indexierung berechnet. Für Schicht Linien (1, 0) und (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Angesichts einer Röhre Radius von 211.57Å, angenähert wir n 10 =- 12, n 01 = 11 (hier die Händigkeit wurde vorgegeben). Mit einer Wiederholung Abstand von 5195.48Å, die Schraube Symmetrie der Röhre wurde als Az bestimmt = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Az und Δφ wurden 7.1321Å und 328,86 verfeinert ° mit IHRSR (Abb. 2a) und der erste Wiederaufbau ist in Abb.. 2b. Die endgültige Rekonstruktion (Abb. 3), nach iterative Verfeinerung, verbesserte sich die Dichte Karte deutlich von der ersten Modells mit IHRSR (Abb. 2b) berechnet.
Abbildung 1. Indizierung von HIV-1 CA Schraubenfeder. (A) Eine einzelne HIV-1 CA A92E Rohr Bild. Scale-bar, 30 nm auf. (B) Die Fourier der Röhre in (A) gezeigt, zu verwandeln. Die spiralförmige Indizes (n 10 =- 12, n 01 = 11) bezeichnet werden. Die Pfeilspitze zeigt auf die Schicht Linie bei 23a-Auflösung.
Abbildung 2. Eine erste Rekonstruktion mit IHRSR. (A) Schrauben Symmetrie Bestimmung für jeden iterativen Zyklus. Δφ und Az, ausgehend von der ursprünglichen Werte, die stabile Werte konvergieren nach 10 Nachiteration Zyklen. (B) Die ersten 3D-density map nach 10 iterative Zyklen.
Abbildung 3. Die 3D-density map nach der iterative Verfeinerung. (AC) Die Dichte Karte CA Rohre als drei orthogonalen Schnitten dargestellt: parallel zur Rohrachse und nahe an der Oberfläche (A), die senkrecht zur Rohrachse (B), und parallel zur und durch die Rohrachse (C) . Scale-Bars, 10 nm auf. (D) Surface Rendering der 3D-density map bei 1.8s konturierte umschließenden 100% vol.
Discussion
Wir präsentieren eine Reihe von Protokollen ein einfacher Ansatz bieten, um 3D-Strukturen von Helix Objekte zu erhalten. Mit dem beschriebenen Verfahren haben wir eine 3D-Struktur von HIV-1 Capsid Montage aus einer einzigen Röhre Bild (176 Segmente). Höhere Auflösung Strukturen können durch darunter mehr Bilddaten erreicht werden.
Es gibt mehrere kritische Punkte zur optimalen Datenerfassung und-analyse: Erstens, bei der Vorbereitung eines Kryo-EM-Probe sollte die Probelösung entfernt ausgelöscht werden, so dass eine gleichmäßige, dünne Schicht aus Lösung, die etwas dicker als die Stichprobengröße ist. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, um die Probe-Blot. Bei bakteriellen Zellen und röhrenförmigen Proben, wie zum Beispiel HIV-1 CA Montage, Löschpapier aus einseitig, vor allem aus der Rückseite, am besten geeignet ist.
Zweitens muss die Händigkeit der Helix bestimmt werden, da dies nicht durch spiralförmige Indizierung oder Rekonstruktion durchgeführt werden. Eine gängige Praxis ist, Gefrierätztechnik, von Rotary Shadowing 18 bis Händigkeit bestimmen gefolgt verwenden. Händigkeit kann auch post-Rekonstruktion bestimmt werden, wenn die Auflösung der Dichte Karte ist ausreichend hoch, die 3D Atommodelle der einzelnen Komponenten sollten gut in der Dichte Karte, wenn eine korrekte Händigkeit angenommen. Andernfalls sollte die Händigkeit angenommen werden.
Drittens sollte ein Wiener-Filter bei der Bildverarbeitung eingesetzt werden, sowohl für Phase und Amplitude Korrektur, um rauscharme Verstärkung zu reduzieren. Da die CTF aus einem einzigen Bild hat immer Nulldurchgänge, ist ein Teil der Informationen im reziproken Raum verloren. Daher ist es notwendig, mehrere Projektion Daten-Sets enthalten zur 3D-Rekonstruktion, die jeweils abgebildeten an verschiedenen defocus Werte.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dr. Gongpu Zhao und Danxia Ke für technische Unterstützung danken. Wir danken Drs. Edward Egelman und Niko Grigorieff für die gemeinsame Nutzung ihrer Bildverarbeitungssoftware. Wir erkennen auch die Mitarbeiter, die Strukturbiologie Kryo-EM-Anlage und Beowulf Cluster-und Grid an der University of Pittsburgh School of Medicine zu unterstützen. Diese Arbeit wurde von GM082251 und GM085043 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
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