Summary
В этой статье описывается метод получения трехмерных (3D) структура спирально собраны молекул с помощью крио-электронной микроскопии. В этом протоколе, мы используем ВИЧ-1 капсида сборки для иллюстрации подробные 3D процедуру реконструкции для достижения плотности карте итеративный винтовой реальном пространстве реконструкции методом.
Protocol
1. Frozen-гидратированных EM подготовки образцов
Поскольку ВИЧ-1 белок капсида (CA) сборки 9 устойчивы лишь в высоких соли (1M NaCl) буфера, что способствует сильный фоновый шум на крио-ЭМ изображений, мы используем быстрого разведения и обратной стороне промокательной метод временно уменьшить соль концентрации при подготовке замороженных гидратированных EM сетки.
- Тлеющий разряд углерода стороне 200-сетка R2 / 1 Quantifoil сетки меди при 25 мА в течение 25 секунд.
- Используйте распылитель довести влажность воздуха в экологические камеры, самодельные поршень ручной тяжести, до 80%.
- В FEI Vitrobot Плунжерные Дьюара, прохладной жидкости этана с использованием жидкого азота. Горы окунуться заморозки Дьюара на ручной поршень тяжести.
- Применяют 2,5 мкл собранном решение CA на углерод сторону сетки, которая крепится на щипцы, и нагрузка на щипцы поршень с углеродом сторону сетки отворачивается от вас.
- Добавить 3 мкл буфера низкие разведения соли (100 мМ NaCl) на обратной стороне сетки и сразу промокните обратной стороне сетки с куском фильтровальной бумаги. Вся поверхность задней части сетки должны быть в тесном контакте с фильтровальной бумагой в течение примерно 6 секунд, прежде чем снимать фильтровальную бумагу. Сразу же окунуться в сетку жидкости этана после удаления фильтровальной бумаги.
- Удалите пинцетом из поршня и быстро перенести сетку в ящик для хранения сетки.
2. Крио-электронной микроскопии CA трубчатых сборки
- Нагрузка замороженных гидратированных сетку в FEI Polara G2 операционный микроскоп электрона на 200kv и оснащен камерой Gatan 4Kx4K ПЗС.
- В условиях низкой дозы режим поиска, при увеличении в ~ 200 раз и с дозой <0.001e - / A 2, экран всей сетки для областей с соответствующими льда и сохранить позиции из этих областей в стадии файла.
- Напомним, сохранили позиции и в дальнейшем экране этих областей при увеличении в 3900 х в низких дозах, в режиме поиска. Выбор районов с равномерным тонким слоем льда, содержащего хорошо разделены, длинные трубки над отверстиями, для сбора данных. Сохранить расположение этих областях в втором файле сцены.
- Переключение в режим экспозиции при увеличении в 59000 х, вставка 100 мкм апертуре объектива, а также настроить цель stigmatism и интенсивность пучка для дозы ~ 15 е - / A 2 в экспозиции.
- Вернуться в низких дозах, в режиме поиска, переход к сохраненной позиции и определить центр и хорошие трубки с помощью камеры CCD. Переключение в режим фокусировки, настроить фокус, и установить расфокусировать значение, как правило, от 0,5 до 2,5 мкм. Переключение в режим экспозиции, установить время экспозиции 0,3-0,5 секунды, при дозе 15 е - / A 2, и собирать изображения. Изображения собраны на тарелку камеры, и фильмы должны иметь возможность поселиться за 10 секунд до воздействия берется.
- Перейти к следующему сохранено положение и повторите шаг 5, чтобы собрать больше изображений.
- Фильмы разработаны в полном составе D19 в течение 12 минут и оцифрованных использовании Nikon SUPER COOLSCAN 9000 ED сканер размером пикселя 6,35 мкм. Формат файлов изображений в формате TIFF.
3. Винтовая индексации
Винтовой объект может быть проиндексирован по двум параметрам: Бесселя, п, и слой номер строки, л. Каждый слой линии в преобразование Фурье, характеризуемое (п, л), соответствующий набор линий на поверхности решетки винтовых объект обозначается (А, к) индексах, используя обозначения из 2D решетке. Для любого (А, к), (п HK, HK л) слой линии линейной комбинации двух основных векторов (№ 10, л 10) и (п 01, л 01), которые п и л значений две основные линии слоя (1, 0) и (0, 1). л может быть получена из высоты слоя измеряется вдоль линии Z оси преобразования Фурье. Значение п может быть оценена по следующей формуле 10
πRr ≈ J н ≈ 1,1 | п | -0,9 .....................( 1)
где J п-функции Бесселя, который определяет интенсивность слой линии й п, г-радиус винтовой объекта, а R-радиус максимальной амплитуды слой линии. Число слоев линии, л, связана с п по правилу отбора 11
л = TN + мкм ....................( 2)
где т и и константы спирали. Для любого данного спирали, может быть именно у единиц точно (или очень близко) с тomplete поворотов.
- Коробка из относительно прямой и длинной трубки с равномерным диаметром с помощью программы EMAN в 12 helixboxer и сохранить изображение в формате MRC.
- Определить расстояние винтовой повторяю, с, с использованием кросс-корреляции основан программы, такие как 'imgccf », в пакет MRC 13.
- Вычислить преобразования Фурье с новой длины поле, интеграл повторить расстояние, с.
- Выберите две основные линии слоя, которые определяют две основные векторы поверхностной решетки (1,0) и (0,1).
- Измерьте радиус трубки, г, а высота и радиус две основные линии слоя в преобразование Фурье, л 10, R 10, L 01 R 01, соответственно (рис. 1).
- Вычислить N 10 и N 01 в соответствии с уравнением (1).
- Так как п значения только оценки, несколько комбинаций N 10 и N 01 проходят испытания на последующих этапах (См. шаг 4.2), чтобы найти правильное винтовой симметрии использованием IHRSR программы пакета.
- Рассчитать винт симметрии описывается двумя вещественными числами: вращение между подразделениями (Δφ) и осевой рост (Δz), с одной-звездочный спирали (п = 1). Учитывая, л 10, л 01, № 10, и N 01 значений, и и т может быть получена путем тестирования диапазон значений м (например, -50 <т <50) в соответствии с правилом отбора. Наконец, Δφ и Δz рассчитываются с использованием Δφ = 360 т / и и Δz = с / у.
4. Трехмерная реконструкция
- Частица сегментации
- Открытое микрофотография содержащих винтовые частиц, используя графический Боксер программа, которая представляет собой программу в пакет EMAN.
- Вырезать спиральной частицы на пересекающиеся сегменты. В панели управления Боксер, выберите Helix режим и установить параметры для бокса: размер окна должен быть больше, чем диаметр частиц и значение для 'Olap' должно быть ~ 90% от размера окна.
- После левой кнопкой мыши на любом конце спиральной частицы, боксер будет автоматически генерировать серии частиц ящики вдоль спирали длиной.
- Сохраните коробку сегментов, а также их координаты.
- Первоначальные 3D реконструкции с использованием IHRSR программ
- Обратить контраст крио-ЭМ изображения и применять фильтрации нижних частот 14 (опционально) до обработки с итерационным винтовой вещественного метода реконструкции пространства (IHRSR).
- Откройте графический интерфейс IHRSR программу, набрав "Генератор". Предоставление графического интерфейса со всей информацией по коробке стек частиц, включая путь и имя стека, число изображений в стеке значения для симметрии параметров и т.д. Нажмите кнопку "Готово", чтобы создать сценарий реконструкции, b25.spi.
- Использование твердого или полый цилиндр в качестве начального отсчета и позволяет процедура цикл пока Есть никаких изменений в определенный винтовой симметрии, которое обычно происходит после нескольких циклов. Право винтовой симметрии должно дать стабильно реконструкции конвергентной. Реконструкция генерируется в последнем цикле будет использоваться в качестве начальной ссылки для дальнейшей доработки. IHRSR выполняет 3D-реконструкции с использованием SPIDER программ.
- Реконструкция с итерационным уточнением 15 3D-реконструкции порожденных IHRSR теперь используется как начальная ссылка на дополнительные уточнения. Во время утонченностью, винтовой симметрии фиксируется на Δφ и Δz, которые определяются по процедуре IHRSR.
- Определите расфокусировать и астигматизма присутствует в микрофотография с помощью программ CTFFIND3 и CTFTILT 16.
- Умножить частиц сегментов CTF использованием программы СПАЙДЕР 17. Операция называется FT в СПАЙДЕР набор используется для вычисления преобразования Фурье (БПФ) в 2D-изображения. После этого БПФ умножается на значения CTF, определяется на предыдущих этапах, с помощью операции называется MU, входящее в пакет СПАЙДЕР. Полученное значение затем обратная трансформируется обратно, чтобы сформировать новое изображение (CTF-исправлено) в реальном пространстве, используя СПАЙДЕР операции, FT снова.
- Выполните соответствующие проекции, сравнивая проекции ссылкой томов с CTF-исправленной картинки, используя мульти-ссылкой выравнивания. Изменение вне плоскости угол наклона ограничен до + / -10 ° и пробы с шагом в 1 °. Ввести ограничения, такие как высокие коэффициенты корреляции, в плоскости углы около 0 ° или 180 °, и ограниченный х смен, для выравнивания параметров каждого сегмента. Включить в реконструкции только те сегменты, которые удовлетворяют ограничениям.
- После каждого итерационного уточнения цикла, 3D-реконструкции создан с помощью обратной проекции и делится на сумму по CTF2.
- Вводить винтовой симметрии для генерации симметризованных объема. Итерационного уточнения прекращается при отсутствии дальнейшего улучшения в решении новых 3D-реконструкция происходит.
- Пакет обработки изображений СПАЙДЕР используется на протяжении большей части уточнения шагов. Ряд операций контролируется скриптами СПАЙДЕР, которые являются созданные пользователем пакетного управления файлами, содержащими последовательности операций и значений параметров. Окончательный реконструкции рассчитывается с использованием программы СПАЙДЕР люкс.
5. Представитель Результаты:
Одного ВИЧ-1 CA A92E трубки (рис. 1а) коробку, и ее преобразование Фурье (рис. 1б) была рассчитана для винтовых индексации. Для слоя линий (1, 0) и (0, 1), л 10 = 28, L 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Учитывая трубки радиусом 211.57Å, мы аппроксимировать N 10 =- 12, N 01 = 11 (здесь, беспристрастности было предопределено). С повторить расстоянии 5195.48Å, винт симметрии трубки была определена как Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz и Δφ были уточнены в 7.1321Å и 328,86 °, используя IHRSR (рис. 2а) и первоначальной реконструкции показана на рис. 2b. Окончательный реконструкции (рис. 3), после итерационным уточнением, улучшенная карта плотности значительно от исходной модели рассчитаны с IHRSR (рис. 2б).
Рисунок 1. Индексация ВИЧ-1 трубка CA винтовой. (А) одного ВИЧ-1 CA A92E ЭОП. Шкала бар, 30 нм. (Б) преобразование Фурье трубки показана на (А). Винтовой индексов (п 10 =- 12, N 01 = 11), обозначим. Стрелка указывает на слой линии 23A разрешения.
Рисунок 2. Первоначальной реконструкции использованием IHRSR. (A) Винт симметрии определение для каждого итерационного цикла. Δφ и Δz, начиная с начальных значений, сходящихся к устойчивых значений после 10 итерационным уточнением циклов. (B), первоначальный 3D карта плотности после 10 итерационные циклы.
Рисунок 3. 3D-карта плотности после итерационным уточнением. (AC) плотность карта CA труб отображается в виде трех ортогональных ломтиками: параллельно оси трубки и близко к поверхности (А), перпендикулярной к оси трубки (B), и параллельно и по оси трубки (С) . Шкала баров, 10 нм. (D) Поверхностный оказание 3D карта плотности контуром на 1.8s вмещающих 100% объеме.
Discussion
Мы представляем набор протоколов, чтобы обеспечить простой подход для получения 3D-структуры спиральных объектов. Использование описанной процедуры, мы приобрели 3D структуре ВИЧ-1 капсида сборки из одного изображения трубки (176 сегментов). Высшие структуры разрешение может быть достигнуто за счет включения большего объема данных изображений.
Есть несколько критических точек для оптимального сбора и анализа данных: во-первых, во время подготовки крио-ЭМ образец, пример решения должны быть уничтожены, оставляя равномерный, тонкий слой раствора, который немного толще, чем размер выборки. Есть несколько различных способов пятно образца. Для бактериальных клеток и трубчатых образцов, таких как ВИЧ-1 CA сборка, промокательной от одной стороны, в частности, с задней стороны, является наиболее подходящим.
Во-вторых, беспристрастности спирали должна быть определена, так как это не может быть сделано путем индексации винтовой или реконструкции. Обычной практикой является использование стоп-травления, а затем поворотные слежку 18 для определения беспристрастности. Беспристрастность может быть определена после реконструкции, когда разрешение плотности карту достаточно высока; 3D атомных моделей отдельных компонентов должны хорошо вписываются плотности карте при правильной беспристрастность предполагается. В противном случае, противоположную направленность следует считать.
В-третьих, фильтр Винера следует применять во время обработки изображения, как для фазовой и амплитудной коррекции, для снижения уровня шума усиления. С CTF от одного изображения всегда имеет нулевое пересечение, часть информации в обратном пространстве теряется. Поэтому, необходимо иметь несколько наборов данных проекции включены для 3D реконструкции, каждый отображаемого при различных значениях расфокусировать.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Gongpu Чжао и Danxia Ke для технической поддержки. Мы благодарим доктора. Эдвард Egelman и Нико Григорьев для обмена их обработки изображений программное обеспечение. Мы также признаем, сотрудники, которые поддерживают структурной биологии крио-ЭМ объекта и Беовульф кластера и сетки в Университете Питтсбурга школа медицины. Эта работа была поддержана GM082251 и GM085043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
References
- Frank, J., Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
- Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
- Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
- Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
- Jimenez, J. L. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
- Butler, P. J., Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
- Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
- Byeon, I. J. L. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
- Toyoshima, C., Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
- Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Yonekura, K., Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
- van Heel, M. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
- Sachse, C. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
- Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
- Frank, J. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).
