Summary
Den här artikeln beskrivs en metod för att få en tredimensionell (3D) strukturen av spiralformade samman molekyler med hjälp av cryo-elektronmikroskopi. I detta protokoll använder vi HIV-1 kapsid församlingar för att illustrera den detaljerade 3D-rekonstruktion förfarande för att uppnå en densitet kartan med den iterativa spiralformade verkliga rymden rekonstruktion metoden.
Abstract
Cryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), kombinerat med bildbehandling, är ett allt kraftfullare verktyg för strukturbestämning av komplex makromolekylära protein och församlingar. I själva verket har enda partikel elektronmikroskopi 1 och två-dimensionella (2D) elektron kristallografi 2 har blivit relativt rutinmässiga metoder och ett stort antal strukturer lösts med hjälp av dessa metoder. Samtidigt har bildbehandling och tredimensionella (3D) rekonstruktion av raka föremål utvecklats snabbt, framför allt, den iterativa spiralformade verkliga rymden rekonstruktion (IHRSR) metod 3, som använder samma verktyg partikelanalys i samband med snedskurna symmetri. Många biologiska enheter funktion i trådar eller mycket riktade former, inklusive aktin filament 4, mikrotuberna 5, fibrer amyloid 6, tobak virus mosaik 7, och bakterier flageller 8, och eftersom en 3D täthet karta över en spiralformad enhet kan uppnås från en enda projektion bild, jämfört med många bilder som krävs för 3D-rekonstruktion av en icke-spiralformade objekt med IHRSR metod, strukturell analys av sådana flexibla och oordnat spiralformade församlingar är nu uppnås.
I denna video artikeln ger vi detaljerade protokoll för att få en 3D densitet karta över en spiralformad protein församling (HIV-1 kapsid 9 är vårt exempel), inklusive protokoll för Cryo-EM extraktion, låg dos datainsamling av Cryo-EM, indexering av raka diffraktion mönster och bildbehandling och 3D-rekonstruktion med hjälp IHRSR. Jämfört med andra tekniker, erbjuder Cryo-EM optimala exemplar bevaras på nära infödda förhållanden. Prover är inbäddade i ett tunt lager av glaskroppen is, genom snabb frysning, och avbildat i elektronmikroskop med flytande kväve temperatur, vid låga doser villkor för att minimera strålskador. Exempel på bilder som erhållits under nära infödda villkor på bekostnad av låg signal och låg kontrast i den inspelade micrographs. Lyckligtvis har processen med spiralformade återuppbyggnaden i stor utsträckning automatiserad, med undantag för indexering av spiralformade diffraktionsmönster. Här beskriver vi en metod att indexera spiralformade struktur och bestämma spiralformade symmetrier (spiralformade parametrar) från digitaliserade micrographs, ett viktigt steg för 3D snedskurna återuppbyggnad. Kortfattat, får vi en första 3D-täthet kartan genom att tillämpa IHRSR metoden. Denna första kartan är sedan iterativt förfinas genom att införa begränsningar för att anpassa parametrarna för varje segment och på så sätt kontrollera sina frihetsgrader. Ytterligare förbättringar uppnås genom att korrigera för kontrasten överföringsfunktionen (CTF) i elektronmikroskop (amplitud och fas korrigering) och genom att optimera spiralformade symmetri församlingen.
Protocol
1. Frysta hydrerad EM extraktion
Eftersom HIV-1 kapsid protein (CA) församlingar 9 är stabila bara i hög salt (1M NaCl) buffert, vilket bidrar starkt bakgrundsbrus i Cryo-EM bilder använder vi en snabb utspädning och back-sida blotting metod för att övergående minska saltet koncentration när de upprättat frysta hydrerad EM rutnät.
- Glow urladdning kolet sidan av 200-mesh R2 / 1 Quantifoil galler koppar i 25mA i 25 sekunder.
- Använd en nebulisatorn för att få fukt i klimatkammare, en hemmagjord manual gravitation kolven, till 80%.
- I FEI Vitrobot kolven Dewar, svalt flytande etan med hjälp av flytande kväve. Montera steget-frysning Dewar på manuella gravitation kolven.
- Applicera 2,5 ìl av förmonterade CA lösning på kol sidan av rutnätet, som är monterad på pincett, och ladda pincetten på kolven med kol sidan av rutnätet vänd bort från dig.
- Tillsätt 3 l med låg salt spädningsbuffert (100 mM NaCl) till baksidan av nätet och omedelbart blot baksidan av rutnätet med en bit filterpapper. Hela baksidan av nätet bör vara i nära kontakt med filterpapper i ca 6 sekunder, innan du tar bort filtrerpapper. Omedelbart kasta nätet i flytande etan efter bort filtrerpapper.
- Ta bort tången från kolven och snabbt överföra nätet i ett rutnät förvaringsbox.
2. Cryo-elektronmikroskopi CA tubulär församlingar
- Ladda frysta hydrerad nätet i en FEI Polara G2 elektronmikroskop som arbetar på 200KV och utrustad med en Gatan 4Kx4K CCD-kamera.
- Enligt lågdos-search-läget vid en förstoring av ~ 200x och med en dos <0.001e - / A 2, skärm hela nätet för områden med lämplig is och spara positionerna för dessa områden i ett skede fil.
- Hämta sparade positioner och ytterligare skärm dessa områden vid en förstoring av 3900 x i låg dos-search-läget. Välj områden med en enhetlig, tunt lager av is som innehåller väl separerade, långa rör över hål, för datainsamling. Spara platser för dessa områden i ett andra steg fil.
- Växla till exponeringsläge vid en förstoring av 59.000 x, infällda en 100 ìm mål bländare och justera målet stigmatism och ljusintensitet för en dos på ~ 15 e - / A 2 per exponering.
- Återgå till låg-dos-sökläge, flytta till ett sparat läge och identifiera och centrera ett bra rör med hjälp av CCD-kameran. Växla till fokusläge, justera fokus, och ange en minskad fokus värde, normalt mellan 0,5 till 2,5 ìm. Växla till exponeringsläge, ställa en exponeringstid på 0,3-0,5 sekunder för en dos av 15 e - / A 2, och samla en bild. Bilderna samlas på ett fat kameran och filmerna bör tillåtas att bosätta sig i 10 sekunder innan en exponering tas.
- Flytta till nästa sparade position och upprepa steg 5 för att samla in fler bilder.
- Filmerna är framtagna i full styrka D19 i 12 minuter och digitaliseras med hjälp av en Nikon SUPER COOLSCAN 9000 ED scanner på en pixelstorlek på 6,35 ìm. Formatet för bildfiler är TIFF.
3. Raka indexering
En spiralformad objekt kan indexeras av två parametrar: Bessel ordning, n och lager radnummer, l. Varje lager rad i Fouriertransformen, som kännetecknas av (n, l), motsvarar en uppsättning linjer på ytan gitter av spiralformade objektet betecknas med (h, k) index, med hjälp av notation från en 2D-gitter. För alla (h, k), är ett (n HK, l hk) skikt linje en linjär kombination av två grundläggande vektorer (n 10, l 10) och (n 01, l 01), som är N-och L värden de två huvudsakliga lager rader (1, 0) och (0, 1). l kan beställas från lagret radhöjd mätt längs Z-axeln i Fouriertransform. Värdet av n kan uppskattas med följande formel 10
πRr ≈ J n ≈ 1,1 | n | -0,9 .....................( 1)
där J n är Bessel-funktionen, som avgör intensiteten i den n: e lagret linje, r är radien på spiralskurna objektet, och R är radien av den maximala amplitud lagret linjen. Lagret radnummer, L, är relaterat till n genom att välja regel 11
l = tn + um ....................( 2)
där t och u är konstanter i helix. För varje given spiral kan det finnas exakt u enheter i exakt (eller mycket nära) t Complete varv.
- Ruta ett relativt rakt och långt rör med konstant diameter med asylnätverket program 12 helixboxer och spara bilden i MRC-format.
- Bestäm spiralformade upprepa avstånd, C, med ett kors-korrelation baserat program, såsom "imgccf" i MRC-paketet 13.
- Beräkna Fouriertransformen med en ny box längd som är en integrerad av upprepade avstånd, c.
- Välj två huvudsakliga lager linjer som definierar två grundläggande vektorer ytan gitter (1,0) och (0,1).
- Mät radien på röret, R och höjden och radien på de två viktigaste skiktet linjer i Fouriertransform, L 10, R 10, L 01 R 01, respektive (bild 1).
- Beräkna N 10 och N 01 enligt ekvation (1).
- Eftersom n värden är bara uppskattning är några kombinationer av n 10 och n 01 testas i senare steg (se steg 4.2) för att hitta rätt spiralformade symmetri med IHRSR programpaket.
- Beräkna skruven symmetri beskrivs av två reella tal: rotation mellan subenheter (Δφ) och axiella stiga (Δz) i en-stjärniga spiral (n = 1). Med tanke på L 10, 01 L, N 10 och N 01 värden kan u och t fås genom att testa ett urval av m värden (t.ex. -50 <m <50) efter valet regeln. Slutligen Δφ och Δz beräknas med hjälp Δφ = 360 t / u och Δz = c / u.
4. Tredimensionell rekonstruktion
- Partikel segmentering
- Öppna ett mikroskop med spiralformad partiklar, med hjälp av grafiska program Boxer, som är ett program i asylnätverket paketet.
- Skär spiralformade partikel i överlappande segment. I kontrollpanelen för Boxer, välj Helix-läge och ställa in parametrarna för boxning: storleken av lådan bör vara större än diametern på partikel och värdet för "OLAP" bör ~ 90% av rutan storlek.
- Efter att vänsterklicka på vardera änden av spiralformade partikel, kommer Boxer automatiskt generera en serie partikel lådor längs spiralen längd.
- Spara boxed segment samt deras koordinater.
- Inledande 3D-rekonstruktion med hjälp IHRSR program
- Invertera kontrast Cryo-EM bilder och tillämpa Lågpassfiltrering 14 (tillval) innan behandling med den iterativa spiralformade verkliga rymden rekonstruktion metoden (IHRSR).
- Öppna det grafiska gränssnittet i IHRSR programmet genom att skriva "Generator". Ge det grafiska gränssnittet med all information för den inramade partiklar stacken, inklusive namn och sökvägen till stacken, antal bilder i högen, värdena för symmetri parametrar osv Klicka på knappen "Slutför" för att skapa återuppbyggnaden manus, b25.spi.
- Använd en fast eller ihålig cylinder som ett första referens och låta förfarandet att cykla tills det inte finns några förändringar i det avgränsade skruv symmetri, som oftast inträffar efter ett par cykler. En rätt spiralformade symmetri bör ge ett stabilt konvergerad rekonstruktion. Återuppbyggnaden genereras i den sista cykeln kommer att användas som en första referens för vidare förädling. IHRSR utför 3D-rekonstruktion med hjälp av SPIDER-program.
- Rekonstruktion med iterativa förfining 15 3D rekonstruktion som genereras av IHRSR används nu som en första referens för ytterligare förfining. Under förfining, är den spiralformade symmetri fastställas till Δφ och Δz, som bestäms utifrån de IHRSR förfarande.
- Bestäm minskad fokus och astigmatism närvarande i mikroskop med hjälp av program CTFFIND3 och CTFTILT 16.
- Multiplicera partikel segment av CTF hjälp av SPIDER-program 17. Operationen kallas FT i SPIDER Suite används för att beräkna Fourier Transform (FFT) i 2D-bilden. Därefter är FFT multipliceras med CTF värden, bestämda i föregående steg, med hjälp av operationen kallas MU inom SPIDER sviten. Det värde som erhålls då omvänd omvandlas tillbaka till en ny bild (CTF-korrigerad) i verkliga rymden med hjälp av SPIDER drift, FT igen.
- Utför projektion matchning genom att jämföra prognoser av hänvisningen volymer med CTF korrigerade-bilder, med hjälp av multi-referens justering. Variationen i ut-ur-planet lutningsvinkel är begränsat till + / -10 ° och provtas i 1 ° steg. Inför begränsningar, såsom höga korrelationskoefficienter, i-planet vinklar nära 0 ° eller 180 °, och begränsade x-skift, för att anpassa parametrarna för varje segment. Inkludera i återuppbyggnaden endast de segment som uppfyller begränsningar.
- Efter varje iterativ förfining cykel är en 3D-rekonstruktion genererats med bakprojektion och dividerat med summan över CTF2.
- Ålägga spiralformade symmetri för att skapa en symmetrized volym. Den iterativa förfining avslutas när ingen ytterligare förbättring av upplösningen av den nya 3D-rekonstruktion inträffar.
- Den bildbehandling paketet SPIDER används för de flesta av förfining steg. En serie av verksamhet styrs av SPIDER skript som skapats av användare batchkontroll filer som innehåller sekvenser av operationer och parametervärden. Den slutliga återuppbyggnaden beräknas med hjälp av program i Spider svit.
5. Representativa resultat:
En enda HIV-1-CA A92E röret (bild 1a) var förpackade ut och dess Fouriertransform (Fig. 1b) beräknades för snedskurna indexering. För lager rader (1, 0) och (0, 1), L 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Givet en tub radie av 211.57Å, anpassade vi n 10 =- 12, n 01 = 11 (här var handedness förutbestämda). Med en upprepning avstånd 5195.48Å var skruven symmetri röret bestäms som Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz och Δφ har förfinats för att 7.1321Å och 328,86 ° med IHRSR (fig. 2a) och den första återuppbyggnaden visas i figur. 2b. Den slutliga rekonstruktion (Figur 3), efter iterativ förädling, förbättrad täthet kartan avsevärt från den ursprungliga modellen beräknad med IHRSR (bild 2b).
Figur 1. Indexering av HIV-1 CA spiralformade rör. (A) en enda HIV-1-CA A92E tub bild. Skala Bar, 30 nm. (B) Fouriertransformen av röret som visas i (A). Den spiralformade index (n 10 =- 12, n 01 = 11) betecknas. Den pilspets pekar på lagret linjen vid 23A upplösning.
Figur 2. En första rekonstruktion med IHRSR. (A) Skruv symmetri som fastställts för vart iterativ cykel. Δφ och Δz, med början från den ursprungliga värden, konvergera mot den stabila värden efter 10 iterativ förfining cykler. (B) Den ursprungliga 3D densitet kartan efter 10 iterativa cykler.
Figur 3. 3D-täthet kartan efter iterativ förfining. (AC) Densiteten karta över Ca rör visas som tre rätvinkliga skivor: parallellt med röret axeln och nära ytan (A), vinkelrätt mot röret axeln (B), och parallellt med och genom röret axeln (C) . Skala barer, 10 nm. (D) Yta rendering av 3D-densitet kartan formad på 1.8s omsluter 100% volym.
Discussion
Vi presenterar en uppsättning protokoll för att ge en okomplicerad metod för att få 3D-strukturer av raka objekt. Använda de beskrivna förfarandena förvärvade vi en 3D-struktur av HIV-1 kapsid församling från en enda tub bild (176 segment). Högre upplösning strukturer kan uppnås genom att ta mer bilddata.
Det finns flera kritiska punkter för optimal datainsamling och analys: Först, under beredningen av ett Cryo-EM prov, bör provlösningen torkas bort och lämnar en enhetlig, tunt lager av lösning som är något tjockare än urvalets storlek. Det finns flera olika sätt att utplåna provet. För bakterieceller och tubulär prover, såsom HIV-1 CA montering, läskpapper från en sida, särskilt från back-sidan är mest lämplig.
För det andra behöver handedness av spiralen som skall fastställas, eftersom detta inte kan göras av spiralformade indexering eller återuppbyggnad. En vanlig metod är att använda freeze-etsning, följt av roterande skugga 18 för att avgöra opartiskhet. Handedness kan också bestämmas efter återuppbyggnaden när upplösningen på densiteten kartan är tillräckligt hög, 3D-atomära modeller av enskilda komponenter ska passa väl in i tätheten kartan när en korrekt handedness förutsätts. Annars bör det motsatta handedness antas.
Det tredje bör en Wiener-filter användas under bildbehandling för både fas och amplitud korrigering, för att minska buller förstärkning. Eftersom CTF från en enda bild har alltid nollgenomgångar är en del av informationen i ömsesidiga rymden förlorade. Därför är det nödvändigt att ha flera projektion datamängder ingår för 3D-rekonstruktion, var avbildad på olika minskad fokus värden.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Gongpu Zhao och Danxia Ke för teknisk support. Vi tackar Dr. Edward Egelman och Niko Grigorieff för att dela sina bildbehandlingsprogram. Vi erkänner också den personal som stödjer Strukturbiologi Cryo-EM anläggning och Beowulf kluster och rutnätet vid University of Pittsburgh School of Medicine. Detta arbete stöddes av GM082251 och GM085043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
References
- Frank, J., Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
- Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
- Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
- Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
- Jimenez, J. L. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
- Butler, P. J., Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
- Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
- Byeon, I. J. L. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
- Toyoshima, C., Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
- Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Yonekura, K., Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
- van Heel, M. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
- Sachse, C. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
- Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
- Frank, J. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).
