Summary
本文介绍了一种方法来获得一个三维（3D）螺旋组装使用低温电子显微镜的分子结构。在这个协议中，我们使用的HIV - 1衣壳集会，说明详细的三维重建过程，实现了由迭代螺旋空间重构方法的密度图。
Abstract
低温电子显微镜（冷冻电镜），与图像处理相结合是一个日益强大的工具结构的大分子蛋白复合物和集会的决心。事实上，单粒子电子显微镜1和二维（2D）电子晶体已成为相对常规的方法和大量的结构已经解决了使用这些方法。同时，图像处理和三维（3D）重建螺旋对象迅速的发展，特别是迭代螺旋真正空间重建（IHRSR） 方法 3，它采用单粒子分析工具，结合螺旋对称。许多生物实体的功能丝状或螺旋形式，包括微丝，微管 5，淀粉样纤维 6，烟草花叶病毒 7，细菌鞭毛 8，因为可以从一个单一的投影实现三维密度图的螺旋实体现在达到的形象，相比非螺旋对象的三维重建所需的许多图像，使用的IHRSR方法，结构分析等灵活和无序的螺旋集会。
在这个视频文章中，我们获得的螺旋蛋白大会的三维密度图（HIV - 1衣壳是我们的榜样），包括冷冻电镜冷冻电镜样品制备，低剂量的数据收集协议，索引提供了详细的协议螺旋衍射图案，图像处理和三维重建，使用IHRSR。与其他技术相比，冷冻电镜接近原生的条件下提供最佳的标本保存。样品嵌在一层薄薄的玻璃体冰，快速冷冻，在电子显微镜和影像在低剂量条件下，在液氮温度下，以尽量减少辐射的伤害。牺牲在低信号和低对比度的记录显微接近原生的条件下获得的样品图像。幸运的是，螺旋重建的过程中已经在很大程度上实现了自动化，索引螺旋衍射图样的异常。在这里，我们描述了一个方法，指数螺旋结构，并确定螺旋对称性，从数字化显微，三维螺旋重建的重要一步（螺旋参数）。简单地说，我们得到一个初始的3D密度地图应用IHRSR方法。这最初的地图，然后反复提炼为每个细分市场的定位参数推出的约束，从而控制他们的自由程度。进一步改善，取得了纠正的对比传递函数（CTF）的电子显微镜（振幅和相位校正），并通过优化大会的螺旋对称性。
Protocol
1。冷冻水合EM样品制备
由于HIV - 1衣壳蛋白（CA）的集会9只在高盐（1M氯化钠）的缓冲区，这有助于在冷冻电镜图像的强大的背景噪声的稳定，我们使用了快速稀释和背面印迹方法瞬时减少盐浓度在编制冻结水合EM网格。
- 辉光放电R2 200目/ 1 Quantifoil铜电网下25毫安的碳端为25秒。
- 使用雾化器带来的湿度环境试验箱，一个自制的手册重力活塞，80％。
- 在费Vitrobot柱塞杜瓦，用液氮冷却液态乙烷。装载到人工重力活塞的暴跌冻结杜瓦。
- 应用到碳端钳上安装的网格，这是预装的CA解决方案的2.5μL，并加载到柱塞与电网面临远离你的碳端的钳。
- 3低盐缓冲液稀释（100毫米氯化钠）液添加到电网的背面，并立即印迹对电网的滤纸背面。整个电网的背面应密切联系，与滤纸约6秒钟，然后取出滤纸。取出滤纸后，立即投身到液态乙烷的网格。
- 从柱塞取出镊子，并迅速转移到一个网格储物盒电网。
2。 CA管状组件的低温电子显微镜
- 费Polara G2电子显微镜操作装入冷冻水合电网200KV及装备与加坦4Kx4K CCD相机。
- 在低剂量的搜索模式，在〜200倍的放大倍率，并具有剂量<0.001e - / 2，屏幕上的整个电网合适的冰，并保存在一个阶段文件这些领域的岗位领域。
- 记得，在放大3900 x在低剂量搜索模式保存的位置，并进一步屏幕上这些地区。选择一个统一的，薄薄的冰含有的过孔层为数据收集，分离良好，长管领域。第二阶段的文件保存在这些地区的位置。
- 切换到放大5.9 X，插图100微米的目标光圈曝光模式，客观stigmatism和束流强度，并调整剂量〜15 E - / 2％曝光。
- 返回到低剂量的搜索模式，移动到保存的位置，并确定和良好的管使用的CCD摄像头的中心。切换对焦模式，调整的重点，并设置一个散焦值，通常在0.5到2.5微米。切换曝光模式，设置为0.3-0.5秒的曝光时间，剂量的15项电子 - / 2，并收集图像。在盘子上的摄像头，图像采集的电影应该被允许定居前10秒曝光。
- 移动到下一个保存的位置，并重复步骤5，以收集更多的图像。
- 电影发展充满力量D19尼康SUPER COOLSCAN 9000 ED扫描仪采用了6.35微米的像素尺寸为12分钟和数字化。图像文件的格式为TIFF。
3。螺旋索引
螺旋对象可以被索引由两个参数：贝塞尔秩序，N，和层的行号，L。每个特点（N，L），傅立叶变换层线，线表面晶格的螺旋对象表示指数（H，K），使用一个二维符号。对于任何（H，K），层线（N 港元 ， 升 香港 ）是两个基本向量（N 10，L 10）和（N 01，L 01），这是N和L值的线性组合可以得到两个主要的层线（1，0）（0，1），L线沿着Z轴的傅立叶变换测量高度层。 n 的值可使用下列公式10估计
πRr≈J ñ≈1.1 | N | -0.9 .....................( 1）
其中J n是贝塞尔函数，这就决定第n层线的强度，R为半径的螺旋对象，R为半径层线的最大振幅。层行号，L，是关系到 n选择第11条
L = TN + UM ....................( 2）
其中T和 U螺旋常数。对于任何给定的的螺旋结构，有可能完全 ü单位完全相同（或非常密切）T Complete打开。
- 开箱与统一使用电子舱单的方案12 helixboxer在湄公河格式保存的图像的直径比较直，长管。
- 确定螺旋重复距离，C，如“imgccf'使用基于互相关方案，在MRC包13，。
- 计算傅立叶变换一个新的框的长度，是一个不可分割的重复距离，C 。
- 选择两个主要的层线定义了两个基本的表面晶格向量（1,0）和（0,1）。
- 测量管的半径，R，和R 10，L 10，傅立叶变换， 升 01 ř 01，（图1）的两个主要的层线的高度和半径。
- 计算N 10 和 N 01根据公式（1）。
- 由于n值只能估算，N 10 和 N 01几个组合进行测试（见步骤4.2），在以后的步骤来找到正确的螺旋对称使用的程序包IHRSR 。
- 计算两个实数所描述的：亚基（Δφ）和轴向一星级螺旋上升（ΔZ）（N = 1）之间的旋转螺丝对称。鉴于01 L 10，L，N 10 和 N 01的值，U和 T可通过测试的M值的范围内（例如，-50 <M <50）按照选拔规则。最后，Δφ和ΔZ计算Δφ= 360吨/ u和ΔZ= C / U。
4。三维重建
- 粒子分割
- 打开一个包含螺旋颗粒的形貌，使用图形化的方案义和团，这是一个在电子舱单包方案。
- 剪切成螺旋颗粒重叠段。在义和团的控制面板，选择“螺旋模式”，并设置拳击参数：框的大小应大于粒子的直径和“OLAP”应框的大小〜90％的价值。
- 螺旋颗粒的两端左击后，义和团会自动生成一个粒子箱沿耳轮长度的系列。
- 保存盒装领域以及它们的坐标。
- 初始三维重建，使用IHRSR方案
- 反转冷冻电镜图像的对比度，适用于低通滤波前 14（可选）处理与迭代螺旋真正的空间重构法（IHRSR） 。
- 打开IHRSR程序的图形界面，键入“发电机”。提供盒装颗粒堆栈的所有信息，包括堆栈，堆栈中的图像的名称和路径的图形界面，为对称参数的值，等点击“完成”按钮创建重建脚本， b25.spi。
- 作为一个初始参考使用固体或空心圆筒，并允许循环的过程，直到有没有定义的螺丝对称的变化，这通常发生后几个周期。一个正确的螺旋对称，应该提供一个稳定的融合重建。在过去的周期中所产生的重建将被用来作为一个初始参考进一步细化。 IHRSR进行三维重建，使用天基信息平台方案。
- IHRSR生成三维重建，重建迭代细化 15现在用来作为一个额外细化的初始参考。在细化，螺旋对称固定在Δφ和ΔZ，这是从IHRSR程序确定。
- 确定在显微镜的使用方案CTFFIND3和CTFTILT 16的散焦和散光目前。
- 乘以使用天基信息平台方案17周大福的粒子段。金融时报“称为天基信息平台套件的操作是用于计算二维图像傅立叶变换（FFT）。此后，FFT乘以由周大福值，在前面的步骤确定，使用操作称为亩的天基信息平台套件内。然后逆变换，形成一个新的形象，在现实空间（CTF -校正），使用天基信息平台操作，金融时报再次得到的值。
- 执行周大福校正后的图像进行比较，参考量的预测，采用多参考对齐投影匹配。在平面倾斜角度的变化是有限的+ / -10 °和1 °取样。引进的限制，如高的相关系数，面角度0 °或180 °，和有限的X -转移附近，为每个细分市场的定位参数。包括在重建只有那些细分，满足约束条件。
- 在每个迭代的细化周期，使用背投影生成一个三维重建和除以总和超过周大福2。
- 对螺旋对称生成一个对称的音量。迭代的细化是终止时，没有发生进一步的改善，在解决新的三维重建。
- 图像处理包蜘蛛是用于最细化的步骤。一系列的操作控制蜘蛛的脚本，这是用户创建的批处理控制文件中包含的操作和参数值序列。最终的重建是计算蜘蛛，浴室中使用的方案。
5。代表性的成果：
一个单一的HIV - 1 CA A92E管（图1A）盒装出螺旋索引计算其傅立叶变换（图1b）。层线（1，0）（0，1），L 10 = 28，L 01 = 37，R 10 = 55，R 01 = 44。鉴于一个211.57Å管半径，我们近似N 10 = 12，N 01 = 11（这里，预定的霸道）。的5195.48Å重复距离，管的螺丝对称被确定为ΔZ= 6.8093Å，Δφ= 328.88 °。 ΔZ和Δφ进行了细化7.1321Å和328.86 ° IHRSR（图2a）和图的初步重建。 2B。最终的重建（图3），迭代的细化后，提高密度图明显IHRSR（图2b）计算初始模型。
图1。HIV - 1 CA斜管的索引。 （一）一个单一的HIV - 1 CA A92E管形象。比例尺，30纳米。 （二）在（a）所示的管傅里叶变换。螺旋指数（N 10 = 12，N 01 = 11）表示。在第23A条的决议层线的箭头指向。
图2。使用IHRSR初步重建。 （一）为每个迭代周期的螺丝对称的决心。 Δφ和ΔZ，从初始值开始，10后收敛到稳定值迭代的细化周期。 （二）10后最初的三维密度图迭代周期。
图3。迭代细化后的三维密度图。 （AC）的CA管密度图显示三个正交切片：管轴平行，接近表面（A），垂直于管轴线（二），和并行，并通过管轴（C） 。比例尺，10纳米。 （四）表面三维密度图呈现封闭100％的体积轮廓在1.8s。
Discussion
我们目前的协议来提供一个简单的方法来获得螺旋物体的三维结构。使用所描述的程序，我们收购了从单管（176段）的HIV - 1衣壳大会的三维结构。包括更多的图像数据结构，可以实现更高的分辨率。
有最佳的数据收集和分析的几个关键点：第一，在一个冷冻电镜标本的制备，样品溶液应被涂抹了，留下一个统一的，略高于样本大小厚的一层薄薄的解决方案。有几种不同的方式印迹样品。对于细菌的细胞和管状的标本，如HIV - 1 CA大会，印迹，特别是从背面，从一个侧，是最合适的。
二，螺旋霸道的需要确定，因为这不能由螺旋索引或重建。一个常见的做法是用冷冻蚀刻，旋转阴影18，以确定霸道。偏手也可以被确定后重建时的密度图的分辨率足够高，各个组件的三维原子模型应符合密度图时假设是正确的霸道。否则，应假设相反的霸道。
第三，应该是一个维纳滤波器在图像处理，相位和幅度校正，以减少噪声放大。由于从一个单一的形象CTF，总是有过零丢失，在倒易空间的信息的一部分。因此，有必要拥有多个投影数据集为每个影像三维重建，包括在不同的散焦值。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢技术支持公仆赵博士和丹霞柯。我们感谢博士。爱德华Egelman和尼科Grigorieff分享他们的图像处理软件。我们也承认的工作人员，支持冷冻电镜设施，并在美国匹兹堡大学医学院的Beowulf集群和电网结构生物学。这项工作是支持由GM082251和GM085043。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
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