Summary
この記事では、低温電子顕微鏡を用いて螺旋状に組み立てられた分子の3次元（3D）構造を取得する方法を説明します。このプロトコルでは、我々は反復ヘリカル実空間再構成法による密度地図を達成するための詳細な3次元再構成の手順を説明するために、HIV - 1キャプシドアセンブリを使用してください。
Abstract
画像処理と組み合わせることで低温電子顕微鏡（クライオEM）は、高分子タンパク質複合体とアセンブリの構造決定のため、ますます強力なツールです。実際には、単一粒子の電子顕微鏡1と2次元（2D）電子線結晶学2は比較的日常的方法論となっていると構造物の多数はこれらのメソッドを使用して解決されている。それと同時に、画像処理とヘリカルのオブジェクトの3次元（3D）再構成は急速に、特に、ヘリカル対称性と併せて単粒子解析ツールを使用してヘリカル実空間の再構築（IHRSR）方法3を 、反復開発しました。アクチンフィラメント4、微小管5、アミロイド繊維6、タバコモザイクウィルス7、及びバクテリアの鞭毛8、および、を含む糸状またはらせんの形態、の多くの生物学的実体の機能ヘリカルエンティティの3D密度マップは、単一の投影から達成することができるので、画像は、非ヘリカルオブジェクトの3D再構成するために必要な多くの画像と比較して、IHRSRメソッドを使用して、このような柔軟性と不規則ヘリカルアセンブリの構造解析は、現在達成可能です。
このビデオの記事では、我々はクライオ- EMによるクライオEMの試料作製、低用量のデータ収集のためのプロトコルを含むヘリカルタンパク質のアセンブリの3D密度マップ（HIV - 1キャプシド9は私たちの例です）、、インデックス作成をobtainingための詳細なプロトコルを提供ヘリカル回折パターン、およびIHRSRを使用して画像処理と3次元再構成の。他の技術に比べ、低温電子顕微鏡は、ほぼネイティブ条件下での最適な標本の保全を提供しています。サンプルは、急速冷凍により、硝子体、氷の薄層に埋め込まれており、放射線損傷を最小限に抑えるために低用量の条件下で、液体窒素温度で電子顕微鏡で画像化されています。サンプル画像は低信号と記録された顕微鏡の低コントラストを犠牲にしてほぼネイティブ条件下で得られる。幸いなことに、ヘリカル再建のプロセスは、主にらせん状の回折パターンのインデックスを作成するのを除いて、自動化されています。ここでは、インデックスらせん構造へのアプローチを説明し、デジタル化された顕微鏡写真から3次元ヘリカル再構成のための不可欠なステップをヘリカル対称性を（ヘリカルパラメータ）を決定します。簡単に言えば、我々はIHRSR法を適用して初期の3次元密度マップを得る。この初期マップは、反復的にこのように自由の学位を制御し、各セグメントの位置合わせパラメータの制約を導入することにより洗練されている。さらなる改善が電子顕微鏡のコントラスト伝達関数（CTF）（振幅と位相の補正）のために補正することにより、組立のらせん対称性を最適化することによって達成されます。
Protocol
1。凍結水和したEM試料作製
HIV - 1キャプシドタンパク質（CA）アセンブリ9低温電子顕微鏡の画像で強力なバックグラウンドノイズを寄与する、唯一の高塩（1M NaCl）をバッファで安定しているため、我々は一時的に塩を低減する方法をブロッティング急速希釈し、裏面を使用してください凍結水和したEMグリッドを準備する濃度。
- 25秒用に25mAの下に200メッシュのR2 / 1 Quantifoil銅グリッドのグロー放電では、炭素側。
- 80％に、、環境室内の湿度をもたらすために自家製マニュアル重力のプランジャーを噴霧器を使用してください。
- FEI Vitrobotプランジャデュワー、液体窒素を使ってクールな液体エタンで。手動の重力のプランジャーにプランジ凍結デュワーをマウントします。
- 鉗子にマウントされているグリッドの炭素側、上に組み立てられたCAのソリューション2.5μLを適用し、あなたから離れて直面しているグリッドの炭素側とプランジャに鉗子を読み込みます。
- グリッドの背面側に低塩の希釈バッファー（100mMのNaCl）を3μlを加え、直ちにろ紙片でグリッドの裏面にしみ。グリッドの全体の裏面には、ろ紙を削除する前に、約6秒間、ろ紙と密接な連絡をしてください。直ちにろ紙を除去した後、液体エタン中にグリッドを突き通す。
- プランジャーから鉗子を外し、すぐにグリッドストレージボックスにグリッドを移す。
2。 CA管状アセンブリの低温電子顕微鏡
- 200kvでFEI Polara G2電子顕微鏡の動作に凍結水和したグリッドをロードし、ガタン4Kx4K CCDカメラを装備。
- 低線量の検索モードの下で、<0.001e〜200倍の倍率でと用量との- / Å 2は 、適切な氷のある地域のためのグリッド全体を審査し、stageファイルでこれらの領域の位置を保存する。
- 低線量の検索モードで3900 xの倍率で保存された位置とさらに画面これらの領域を思い出してください。データ収集のために、穴の上に十分に分離、長い管を含む氷の均一な、薄層で領域を選択します。第二段階のファイルにこれらの領域の場所を保存してください。
- 露出あたり/ Å 2 - 59000 X、はめ込み100μmの目標の開口部、および〜15 Eの投与のための客観的紅斑出現し、ビーム強度を調整するの倍率で露出モードに切り替えます。
- 低線量の検索モードに戻るには、保存した位置に移動し、CCDカメラを用いて良好なチューブを識別し、センター。フォーカスモードに切り替えて、フォーカスを調整し、0.5〜2.5μmの間で、通常、デフォーカス値を設定します。露出モードに切り替え、15 Eの投与量については、0.3から0.5秒の露光時間を設定します- / Å 2、および画像を収集する。画像は、プレートのカメラで収集され、露光が行われる前に、フィルムは10秒間静置してください。
- 次に保存した位置に移動し、より多くの画像を収集するために手順5を繰り返します。
- フィルムは12分間フル強度D19で開発され、6.35ミクロンのピクセルサイズでニコンスーパーCOOLSCAN 9000 EDのスキャナを使用してデジタル化されています。画像ファイルの形式はTIFFです。
3。ヘリカルインデックス作成
ベッセル次数 n、およびレイヤの行番号、L：ヘリカルオブジェクトは、2つのパラメータでインデックスを作成することができます。として（N、L）を特徴とフーリエ変換の各レイヤの線は、2次元格子から表記を使用して、（H、K）のインデックスで表される螺旋状の物体の表面の格子上にラインのセットに対応しています。任意の（H、K）の場合は、（N HK、L HK）層の線は、NおよびLの値である2つの基本的なベクトル（nは 10、L 10）と（N 01、L 01）、の線形結合である二つの主要層の線（1,0）と（0,1）。lはフーリエ変換でZ軸に沿って測定されたレイヤの行の高さから取得することができます。 nの値は次の式10を用いて推定することができます
πRr≈J のn≈1.1 | N | -0.9 .....................( 1）
J nは n 番目の層線の強度を決定するベッセル関数、ここで、rはヘリカルオブジェクトの半径であり、そしてRは、層線の最大振幅の半径です。レイヤの行番号、lは 、選択ルール11でnに関連している
L = TN + UM ....................( 2）
ここで、t と u は、螺旋の定数である。任意のらせんの場合は、（または非常に密接に）正確にはT Cを正確にuは単位があるかもしれませんompleteになります。
- EMANのプログラム12 helixboxerを使用して均一な直径を持つ比較的まっすぐで長いチューブ外箱とMRCの形式で画像を保存する。
- MRCのパッケージ13のような"imgccf"として相互相関ベースのプログラムを使用してヘリカルリピート距離、cを 、、、決定する。
- 繰り返し距離、cの積分である新しいボックスの長さでフーリエ変換を計算する。
- 二つの基本的な表面の格子ベクトル（1,0）を定義し、（0,1）は、2つの主要な層の行を選択してください。
- それぞれ、R 01 L 10、R 10、L 01、管の半径、r、およびフーリエ変換の2つの主要な層の線の高さと半径を測定する（図1）。
- 式（1）にしたがってnを 10とN 01を計算する。
- n個の値しか推定なので、nを 10とN 01のいくつかの組み合わせがプログラムパッケージIHRSRを使用して、正しいらせん対称性を見つけるために（ステップ4.2を参照）後のステップでテストされています。
- サブユニット間のローテーション（Δφ）と一つ星のらせん（N = 1）の軸方向の上昇（ΔZ）：2つの実数で記述されたネジの対称性を計算する。 L 10、L 01、N 10、N 01の値を与え、uとtは、選択規則に従ってm個の値の範囲（例えば、-50 <M <50）をテストすることによって得ることができます。最後に、ΔφとΔZはΔφ= 360 T / UとΔZ= C / Uを使用して計算されます。
4。三次元再構築
- 粒子のセグメンテーション
- EMANのパッケージ内のプログラムのグラフィカルプログラムのボクサーを、使用して、らせん状粒子を含む顕微鏡写真を開きます。
- 重複するセグメントにヘリカル粒子をカット。ボクサーのコントロールパネルでは、Helixのモードを選択し、ボクシングのパラメータを設定する：箱の大きさは粒子の直径よりも大きくする必要があり、"OLAP"の値は、ボックスの大きさの〜90％でなければならない。
- ヘリカル粒子のいずれかの端を左クリックした後、ボクサーは自動的にらせんの長さに沿って粒子の一連のボックスを生成します。
- 箱入りのセグメントだけでなく、それらの座標を保存します。
- IHRSRプログラムを使用して初期の三次元再構成
- 低温電子顕微鏡像のコントラストを反転し、反復ヘリカル実空間の再構成法（IHRSR）で処理する前に14（オプション）ローパスフィルタリングを適用する。
- "ジェネレータ"と入力してIHRSRプログラムのグラフィカルインタフェースを開きます。スタックの名前とパスを含む箱入り粒子のスタックのすべての情報、とグラフィカルインタフェース、スタック内の画像の数を提供する、対称性のパラメータなどの値は、再建のスクリプトを作成するためのボタン"Finish"をクリックして、 b25.spi。
- 初期のリファレンスとして実又は中空の円筒を使用し、通常は数サイクル後に発生する定義されているネジの対称性、に変更がないまで、サイクルへの手続きを可能にする。右ヘリカル対称性は、安定的に収束の再建を与える必要があります。最後のサイクルで生成された再建は、さらなる改良のための最初の基準として使用されます。 IHRSRはSPIDERプログラムを使用して三次元再構成を実行します。
- 反復改良15との再建はIHRSRによって生成された3D再構築は、現在追加の改良のための最初の基準として使用されます。洗練された中に、ヘリカル対称性は、ΔφとIHRSRの手順から決定されるΔZ、に固定されています。
- プログラムCTFFIND3とCTFTILT 16を使用して顕微鏡でデフォーカスと非点収差の存在を決定する。
- SPIDERプログラム17を使用してCTFによる粒子のセグメントを掛けます。 SPIDERのスイートでFTと呼ばれる操作は、2次元画像のフーリエ変換（FFT）を計算するために使用されます。その後、FFTはSPIDERスイート内のMUと呼ばれる操作を使用して、前の手順で決定した、CTFの値が乗算されます。得られた値は、再び、SPIDERの操作を使用して実空間でのFTを新しいイメージを（CTF補正）を形成する逆変換、逆です。
- マルチリファレンスアラインメントを使用して、CTF -補正画像と参照量の予測を比較することによって、投影のマッチングを行います。面外傾斜角の変化は、+ / -10 °に制限し、1 °ステップでサンプリングされます。このような各セグメントのアラインメントパラメータの0 °または180 °、およびX -シフト限定、近くに高い相関係数、面内の角度などの制約を導入する。制約を満たす再建のみのセグメントに含まれています。
- それぞれが洗練サイクルを反復した後、3D再構築は、CTFにわたって合計で逆投影を使用して生成され、分割されています2。
- 対称化ボリュームを生成するらせん対称性を課す。新しい3D復元の解決にはさらなる改善が発生していないときに反復改良は終了します。
- 画像処理パッケージSPIDERは、洗練されたステップのほとんどに使用されます。一連の操作は、操作とパラメータ値の配列を含むユーザが作成したバッチコントロールファイルであるSPIDERのスクリプトによって制御されます。最終的な再建は、SPIDERスイートでプログラムを使用して計算されます。
5。代表的な結果：
単一のHIV - 1 CA A92Eチューブ（図1a）は、箱入りの出であり、そのフーリエ変換（図1b）はヘリカルインデックス作成のために算出した。レイヤの線（1,0）と（0,1）に対して、L 10 = 28、L 01 = 37、R 10 = 55、R 01 = 44。 211.57Åのチューブの半径を考えると、我々は、N 10 =- 12、nは 01 = 11（ここで、利き手が所定した）近似。 5195.48Åの繰り返しの距離で、管のねじの対称性は、ΔZのように決定された= 6.8093Å、Δφ= 328.88 °。 ΔZ、Δφは7.1321Åと328.86に洗練°でIHRSR（図2a）と初期の再建を使用することは図に示されています。図2b。最終的な復興（図3）、反復改良した後、IHRSR（図2b）で計算された初期のモデルから大幅に密度マップを改善。
図1 HIV - 1 CAヘリカルチューブのインデックス作成。 （A）、単一のHIV - 1 CA A92Eチューブの画像を。スケールバー、30nmの。 （B）フーリエ変換（A）に示すようにチューブの変換。ヘリカル指数（N 10 =- 12、nは 01 = 11）が示されています。 23Aの解像度でレイヤーの線に矢印をポイントします。
図2。IHRSRを使用して初期の再建。各反復サイクルのための（A）スクリューの対称性の決定。 10は改良のサイクルを反復した後、ΔφとΔZは、初期値から開始し、安定した値に収束する。 （B）10、反復サイクル後の最初の3次元密度マップ。
図3。反復改良後の3次元密度マップ。 （AC）CAチューブの密度マップは、3つの直交スライスとして表示されます。チューブ軸に平行して管軸（B）に対して垂直に、表面（）に近い、と平行管軸（C）へと経由。スケールバーは10nm。 （D）3次元密度マップの表面のレンダリングには、100％の体積を囲む1.8sで輪郭。
Discussion
我々は、螺旋状物体の3次元構造を取得するためのわかりやすいアプローチを提供する一連のプロトコルを提示する。記載された手順を使用して、我々は、シングルチューブのイメージ（176セグメント）からHIV - 1キャプシドアセンブリの3D構造を取得しました。高分解能構造は、より多くの画像データを含むことによって達成することができます。
最適なデータ収集と分析のためのいくつかの重要なポイントがあります：まず、低温電子顕微鏡の試料の準備中に、試料溶液はサンプルのサイズよりもやや厚くなるソリューションの均一な、薄い層を残して、ブロットされるべきである。サンプルをブロットにいくつかの異なる方法があります。このようなHIV - 1 CAアセンブリとして細菌細胞および管状試験片については、特に背面側から、片側からブロッティング、最も適切です。
第二に、らせんの利き手は、これがヘリカルインデックス作成または再構築によって行うことができないとして、決定する必要がある。一般的な方法は、利き手を判断するために18をシャドウイングロータリー続いて、凍結エッチングを使用することです。密度マップの解像度が十分に高い場合に利き手は、ポスト再建を決定することができます。正しい利き手が想定される場合、個々の成分の3次元原子モデルは、密度マップによく適合している必要があります。そうでなければ、反対の利き手を仮定する必要があります。
第三に、ウィーナーフィルタは、ノイズの増幅を低減するため、位相と振幅補正の両方に対して、画像処理中に使用する必要があります。単一のイメージからCTFは常にゼロ交差を持っているので、逆格子空間内の情報の一部は失われます。したがって、それは別のデフォーカス値で3次元再構成、各画像形成されたために含まれる複数の投影データをセット持っていることが必要である。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、技術サポートのために博士は公僕趙と丹霞柯に感謝します。我々は、博士に感謝する。それらの画像処理ソフトウェアを共有するためのエドワードEgelmanとNiko Grigorieff。我々はまた、医学のピッツバーグ大学大学の構造生物学低温電子顕微鏡施設、Beowulfクラスタおよびグリッドをサポートするスタッフを認めます。この作品は、GM082251とGM085043によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
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