Summary
Este artigo descreve um método para obter uma estrutura tridimensional (3D) das moléculas helicoidalmente montados usando crio-microscopia eletrônica. Neste protocolo, usamos assembléias HIV-1 capsídeo para ilustrar o processo de reconstrução 3D detalhados para alcançar um mapa de densidade pelo método de reconstrução iterativa helicoidais real-espaço.
Abstract
Cryo-microscopia eletrônica (Cryo-EM), combinado com processamento de imagem, é uma ferramenta cada vez mais poderosos para a determinação da estrutura de complexos macromoleculares de proteínas e montagens. Na verdade, microscopia eletrônica única partícula 1 e bidimensional (2D) de elétrons cristalografia de dois tornaram-se relativamente metodologias de rotina e um grande número de estruturas foram resolvidos com estes métodos. Ao mesmo tempo, processamento de imagem e reconstrução tridimensional (3D) de objetos helicoidal tem se desenvolvido rapidamente, especialmente, a iterativa helicoidal espaço real de reconstrução do método (IHRSR) 3, que utiliza ferramentas de análise única partícula em conjunto com simetria helicoidal. Muitas entidades biológicas função em formas filamentosas ou helicoidais, incluindo filamentos de actina 4, 5 microtúbulos, fibras amilóides 6, vírus do mosaico do tabaco 7, 8 e flagelos de bactérias, e, por um mapa de densidade 3D de uma entidade helicoidal pode ser alcançado a partir de uma única projeção imagem, em comparação com as imagens muitas necessários para a reconstrução 3D de um objeto não-helicoidal, com o método IHRSR, análise estrutural de tais flexível e desordenada assembléias helicoidais agora é atingível.
Neste artigo de vídeo, nós fornecemos protocolos detalhados para a obtenção de um mapa 3D da densidade de um conjunto de proteínas helicoidal (HIV-1 capsídeo 9 é nosso exemplo), incluindo protocolos para crio-EM preparação de amostras, uma dose baixa de coleta de dados por Cryo-EM, a indexação de padrões de difração helicoidal, e processamento de imagem e reconstrução 3D usando IHRSR. Em comparação com outras técnicas, crio-preservação EM oferece espécime ideal sob condições quase nativo. Amostras são incorporados em uma fina camada de gelo vítreo, por congelação rápida, e com imagens em microscópios de elétrons à temperatura de nitrogênio líquido, sob condições de baixas doses para minimizar os danos da radiação. Imagens da amostra são obtidas sob condições quase nativo à custa de sinal baixo e de baixo contraste nas micrografias registradas. Felizmente, o processo de reconstrução helicoidal tem sido amplamente automatizado, com exceção de indexar o padrão de difração helicoidal. Aqui, descrevemos uma abordagem para indexar estrutura helicoidal e determinar simetrias helicoidal (parâmetros helicoidais) de micrografias digitalizadas, um passo essencial para a reconstrução 3D helicoidal. Brevemente, obtemos um mapa de densidade inicial de 3D, aplicando o método IHRSR. Este mapa inicial é, então, iterativamente refinados através da introdução de restrições para os parâmetros de alinhamento de cada segmento, assim, controlar os seus graus de liberdade. Aperfeiçoamento é alcançado através da correcção para a função de transferência de contraste (CTF) do microscópio eletrônico (correção de amplitude e fase) e, otimizando a simetria helicoidal da assembléia.
Protocol
1. Frozen-hidratado preparação de amostras EM
Porque o HIV-1 proteína capsídeo (CA) 9 assembléias são estáveis apenas no sal de alta (1M NaCl) buffer, o que contribui o ruído de fundo forte em crio-EM imagens, usamos uma diluição rápida e verso-blotting método para reduzir temporariamente o sal concentração na preparação do frozen-hidratado grade EM.
- Descarga luminescente lado de carbono de 200 mesh-R2 / 1 grades de cobre Quantifoil sob 25mA por 25 segundos.
- Use um nebulizador para trazer a umidade na câmara ambiental, um home-made êmbolo gravidade manual, para 80%.
- Na FEI Vitrobot Plunger dewar, etano líquido frio usando nitrogênio líquido. Monte o dewar mergulhar congelamento sobre o êmbolo gravidade manual.
- Aplicar 2,5 mL de solução preassembled CA para o lado de carbono da grade, que é montada em uma pinça, e coloque a pinça para o êmbolo com o lado de carbono da grade de frente para longe de você.
- Adicionar 3 mL de tampão de diluição baixa em sal (100 mM NaCl) para a parte de trás da grade e imediatamente blot a parte de trás da grade com um pedaço de papel de filtro. A superfície de volta toda a grade deve estar em estreito contacto com o papel de filtro para cerca de 6 segundos, antes de remover o papel de filtro. Imediatamente mergulhar a grade em etano líquido após a remoção do papel de filtro.
- Remova a pinça do êmbolo e rápida de transferir a grade em uma caixa de armazenamento de rede.
2. Cryo-microscopia eletrônica de CA tubular assembléias
- Carregar a grade de frozen-hidratado em um G2 Polara FEI operacional microscópio eletrônico de 200KV e equipado com uma câmera CCD Gatan 4Kx4K.
- No modo de baixa dosagem de busca, com uma ampliação de 200x ~ e com uma dose <0.001e - / A 2, tela de toda a rede para áreas com gelo adequado e salvar as posições destas áreas em um arquivo de palco.
- Lembre-se das posições salvo e tela ainda mais estas áreas com uma ampliação de 3.900 x no modo de baixa dosagem de busca. Selecionar as áreas com uma camada uniforme e fina de gelo que contém bem separados, tubos longos sobre buracos, para coleta de dados. Guardar os locais dessas áreas em um arquivo de segundo estágio.
- Mude para o modo de exposição com uma ampliação de 59.000 x, inset a 100 mM Abertura da objectiva, e ajustar a estigmatização objetivo e intensidade do feixe para uma dose de ~ 15 e - / Å 2 por exposição.
- Retornar ao modo de baixa dose de busca, mover para uma posição salva e identificar e centro de um tubo bom usar a câmera CCD. Mude para o modo de foco, ajustar o foco, e definir um valor defocus, normalmente entre 0,5-2,5 mM. Mude para o modo de exposição, definir um tempo de exposição de 0,3-0,5 segundos, para uma dose de 15 e - / a 2, e recolher uma imagem. As imagens são coletadas em uma câmera de placa, e os filmes devem ser autorizados a se contentar com 10 segundos antes de uma exposição é tomada.
- Mover para a próxima posição salvos e repita o passo 5 para coletar mais imagens.
- Os filmes são desenvolvidos com toda a força D19 por 12 minutos e digitalizados usando uma Nikon SUPER COOLSCAN 9000 ED scanner em um tamanho de pixel de 6,35 mM. O formato de arquivos de imagem TIFF é.
3. Indexação helicoidais
Um objeto helicoidais podem ser indexados por dois parâmetros: a ordem Bessel, n, eo número de camada de linha, l. Cada linha da camada na transformada de Fourier, como caracterizado por (n, l), corresponde a um conjunto de linhas na rede superfície do objeto helicoidais denotada por (h, k) índices, usando a notação de uma treliça 2D. Para qualquer (h, k), uma linha de camada (n hk, l hk) é uma combinação linear de dois vetores básicos (n 10, l 10) e (n 01, l 01), que são os valores n e l de as duas linhas camada principal (1, 0) e (0, 1). l pode ser obtida a partir da altura da linha da camada medida ao longo do eixo Z na transformada de Fourier. O valor de n pode ser estimado usando a seguinte equação 10
πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 .....................( 1)
onde J n é a função Bessel, que determina a intensidade da linha da camada n ª, r é o raio do objeto helicoidal, e R é o raio da amplitude máxima da linha da camada. O número da linha da camada, l, está relacionado com n pela regra de seleção 11
l = tn + hum ....................( 2)
onde t e u são constantes da hélice. Para qualquer hélice dado, pode haver unidades exatamente u exatamente (ou muito perto) t complete voltas.
- Caixa de um tubo relativamente simples e longo com diâmetro uniforme usando o REMA do programa de 12 helixboxer e salvar a imagem em formato MRC.
- Determinar a distância de repetição helicoidal, c, usando um programa de correlação cruzada baseada, como 'imgccf', no pacote de MRC 13.
- Calcule a transformada de Fourier com um comprimento nova caixa que é parte integrante da distância repetir, c.
- Escolha duas linhas principais que definem camada de dois vetores de superfície básica treliça (1,0) e (0,1).
- Medir o raio do tubo, r, ea altura e raio da camada de duas linhas principais de transformada de Fourier, l 10, R 10, l 01 R 01, respectivamente (Fig. 1).
- Calcular n 10 e n 01 de acordo com a equação (1).
- Uma vez que os valores n são apenas estimativas, algumas combinações de n 10 e 01 n são testados em etapas posteriores (Veja o passo 4.2) para encontrar a simetria helicoidal correto usando o IHRSR pacote do programa.
- Calcular a simetria parafuso descrito por dois números reais: a rotação entre as subunidades (Δφ) ea ascensão axial (Δz) da hélice de uma estrela (n = 1). Dado l 10, l 01, n 10, e n 01 valores, u e t podem ser obtidos pelo teste de uma faixa de valores m (por exemplo, -50 <m <50) de acordo com a regra de seleção. Finalmente, Δφ e Δz são calculados usando Δφ = 360 t / u e Δz = c / u.
4. Reconstrução tridimensional
- Segmentação de partículas
- Abra uma micrografia contendo partículas helicoidais, usando o Boxer programa gráfico, que é um programa no pacote REMA.
- Cortar a partícula em segmentos helicoidais sobrepostas. No painel de controle do Boxer, escolher o modo de Helix e definir os parâmetros para o boxe: o tamanho da caixa deve ser maior que o diâmetro da partícula eo valor para 'Olap' deve ser ~ 90% do tamanho da caixa.
- Depois de esquerda clicando em uma das extremidades da partícula helicoidal, Boxer irá gerar automaticamente uma série de caixas de partículas ao longo do comprimento da hélice.
- Salvar os segmentos em caixa, bem como suas coordenadas.
- Reconstrução 3D inicial usando programas IHRSR
- Inverter o contraste das imagens Cryo-EM e aplicar filtragem passa-baixa 14 (opcional) antes do processamento com o método de reconstrução iterativa helicoidal espaço real (IHRSR).
- Abrir a interface gráfica do programa IHRSR digitando "Generator". Proporcionar a interface gráfica com todas as informações para a pilha de partículas em caixa, incluindo o nome eo caminho da pilha, número de imagens na pilha, os valores para os parâmetros de simetria, etc Clique no botão "Finish" para criar o script de reconstrução, b25.spi.
- Use um cilindro sólido ou oco como uma referência inicial e permitir que o procedimento para o ciclo até que não haja mudanças na simetria parafuso definida, o que geralmente ocorre após alguns ciclos. A simetria helicoidal direito deve dar a uma reconstrução convergentes de forma estável. A reconstrução gerado no último ciclo será usado como uma referência inicial para aperfeiçoamento. IHRSR executa programas de reconstrução em 3D usando o SPIDER.
- Reconstrução com refinamento iterativo 15 A reconstrução 3D gerados por IHRSR é agora utilizada como uma referência inicial para o refinamento adicional. Durante o refinamento, a simetria helicoidal é fixado em Δφ e Δz, que são determinados a partir do procedimento IHRSR.
- Determinar a desfocagem e apresentar astigmatismo na micrografia usando programas CTFFIND3 e CTFTILT 16.
- Multiplicar os segmentos de partículas pela CTF usando programas SPIDER 17. A operação denominada FT na suíte SPIDER é usado para calcular a transformada de Fourier (FFT) da imagem 2D. Posteriormente, a FFT é multiplicado por valores CTF, apurado nas etapas anteriores, usando a operação denominada MU dentro do conjunto SPIDER. O valor obtido é então transformada inversa de volta para formar uma nova imagem (CTF-corrigida) no espaço real, utilizando a operação SPIDER, FT novamente.
- Realizar com a projeção, comparando as projeções dos volumes de referência com o CTF corrigida imagens, usando multi-referência de alinhamento. A variação no ângulo de inclinação fora do plano é limitado a + / -10 ° e amostrados em passos de 1 °. Introduzir restrições, tais como altos coeficientes de correlação, no plano ângulos perto de 0 ° ou 180 °, e limitado x turnos, para os parâmetros de alinhamento de cada segmento. Incluir na reconstrução apenas os segmentos que satisfazer as restrições.
- Depois de cada ciclo iterativo de refinamento, uma reconstrução 3D é gerado usando a projeção para trás e dividido pela soma sobre o CTF2.
- Impor a simetria helicoidal para gerar um volume simetrizada. O refinamento iterativo é encerrado quando não há melhoria na resolução da reconstrução 3D novo ocorre.
- A imagem SPIDER pacote de processamento é utilizado para a maioria das etapas de refinamento. Uma série de operações são controladas por scripts SPIDER, que são arquivos criados pelo usuário controlo de lotes contendo seqüências de operações e valores dos parâmetros. A reconstrução final é calculado usando programas em SPIDER suite.
5. Resultados representativos:
A única HIV-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) estava fora encaixotado e sua transformada de Fourier (Figura 1b) foi calculado para indexação helicoidal. Para as linhas de nível (1, 0) e (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Dado um tubo de raio 211.57Å, nós aproximada n 10 =- 12, n 01 = 11 (aqui, a lateralidade foi pré-determinado). Com uma distância de repetição do 5195.48Å, a simetria do parafuso do tubo foi determinada como Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz e Δφ foram refinados para 7.1321Å e 328,86 ° usando IHRSR (Fig. 2a) ea reconstrução inicial é mostrado na figura. 2b. A reconstrução final (Fig. 3), depois de refinamento iterativo, melhorou o mapa de densidade significativamente a partir do modelo inicial calculado com IHRSR (Fig. 2b).
Figura 1. Indexação de HIV-1 tubo helicoidal CA. (A) A única HIV-1 CA tubo de imagem A92E. Barra de escala, 30 nm. (B) A transformada de Fourier do tubo mostrado em (A). Os índices helicoidal (n 10 =- 12, n 01 = 11) são indicadas. A seta aponta para a linha de camada em resolução 23A.
Figura 2. Uma reconstrução inicial usando IHRSR. (A) determinação simetria Parafuso para cada ciclo iterativo. Δφ e Δz, a partir dos valores iniciais, convergem para os valores estáveis após 10 ciclos iterativos requinte. (B) O mapa de densidade inicial em 3D depois de 10 ciclos iterativos.
Figura 3. O mapa de densidade 3D após a refinamento iterativo. (AC) O mapa de densidade de CA tubos é exibido como três fatias ortogonais: paralela ao eixo do tubo e próximo à superfície (A), perpendicular ao eixo do tubo (B), e em paralelo e através do eixo do tubo (C) . Barras de escala, 10 nm. (D) a prestação de superfície do mapa de densidade de contorno 3D em 1.8S colocando 100% em volume.
Discussion
Apresentamos um conjunto de protocolos para fornecer uma abordagem simples para obtenção de estruturas 3D de objetos helicoidal. Utilizando os procedimentos descritos, nós adquirimos uma estrutura 3D do HIV-1 montagem do capsídeo de um único tubo de imagem (176 segmentos). Estruturas de alta resolução pode ser alcançado através da inclusão de mais dados de imagem.
Existem vários pontos críticos para a coleta de dados e análise ideal: primeiro, durante a preparação de uma amostra de crio-EM, a solução da amostra devem ser apagados, deixando uma camada fina e uniforme de solução que é ligeiramente mais espessa do que o tamanho da amostra. Existem várias maneiras diferentes para apagar a amostra. Para bactérias e células de amostras tubular, tais como HIV-1 CA montagem, mata-borrão de um lado, particularmente na parte de trás lado, é mais adequado.
Segundo, a lateralidade da hélice precisa ser determinado, como esta não pode ser feito por indexação helicoidal ou reconstrução. Uma prática comum é usar freeze-ataque, seguido pelo rotary shadowing 18 para determinar a lateralidade. Destreza manual também pode ser determinado pós-reconstrução quando a resolução do mapa de densidade é suficientemente elevada; os modelos 3D atômico de componentes individuais devem se encaixar bem no mapa de densidade quando um handedness correta é assumida. Caso contrário, a lateralidade oposto deve ser assumida.
Terceiro, um filtro de Wiener deve ser usado durante o processamento de imagem, tanto para fase e correção de amplitude, para reduzir a amplificação de ruído. Desde o CTF de uma única imagem sempre tem cruzamentos de zero, parte da informação no espaço recíproco é perdido. Portanto, é necessário dispor de dados de projeção vários conjuntos incluídos para reconstrução 3D, cada um com imagens em valores defocus diferente.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Gongpu Zhao e Danxia Ke para suporte técnico. Agradecemos a drs. Edward Egelman e Niko Grigorieff para compartilhamento de seus softwares de processamento de imagem. Reconhecemos também o pessoal de apoio da Biologia Estrutural Cryo-EM facilidade e Beowulf cluster e grade da Universidade de Pittsburgh School of Medicine. Este trabalho foi financiado pela GM082251 e GM085043.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | ||
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI | ||
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan | ||
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | ||
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools | ||
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | ||
| EM software IHRSR | Programs available from Edward H. Egelmanhttp://people.virginia.edu/~ehe2n/ | ||
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
| MRC based helical processing software | Programs available from Koji Yonekurahttp://www.riken.jp/biostrmech/index.html | ||
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
References
- Frank, J., Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
- Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium - Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
- Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
- Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
- Jimenez, J. L. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
- Butler, P. J., Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
- Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
- Byeon, I. J. L. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
- Toyoshima, C., Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
- Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Yonekura, K., Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
- van Heel, M. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
- Sachse, C. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
- Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
- Frank, J. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).
