إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك

Summary

في هذا الفيديو نظهر إعداد E18 العصبونات القشرية الجرذ.

Abstract

في هذا الفيديو ، ونبدي استعدادا للE18 الخلايا العصبية الفئران القشرية. ويتم الحصول على الخلايا العصبية الفئران E18 E18 القشرية من القشرة تشريح الفئران الجنينية وأعدت مسبقا. القشرة E18 هو ، على تشريح ، فصلها فورا في الخلايا العصبية الفردية. فمن الممكن لتخزين E18 في القشرة العازلة E إسبات B27 تحتوي على 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل تنفيذ الانفصال. ومع ذلك ، سيكون هناك انخفاض في بقاء الخلية. عادة نحن لدينا الحصول على E18 جديدة اللحاء. ينقل إلى المختبر في البرد الثلج الكالسيوم المغنيسيوم العازلة تشريح حرة حرة (CMFM). لدى وصوله ، يضاف إلى التربسين القشرة إلى التركيز النهائي 0.125 ٪. ومن ثم حضنت القشرة عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. يضاف DMEM FBS تحتوي على 10 ٪ في القشرة لوقف التفاعل. ثم يتم طرد القشرة عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تتم إزالة طاف و 2 مل من وسائل الإعلام بصل العصبية (NBM) التي تحتوي على 2 ٪ B27 (المجلد / المجلد) و 0.25 ٪ يضاف Glutamax (المجلد / المجلد) إلى القشرة التي هي ثم إعادة علقتها pipetting صعودا وهبوطا. المقبل ، هو مسحوق القشرة مع ماصات النار سابقا الزجاج المصقول ، مع كل افتتاح المتعاقبة أصغر. بعد الطحن ، يتم طرد مرة أخرى القشرة في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تتم إزالة ثم طاف بيليه والقشرة إعادة العالقة مع 2 مل من NBM تحتوي B27 وGlutamax. ثم يتم تمرير تعليق الخلية من خلال 40 مصفاة أم النايلون الخلية. المقبل يتم الاعتماد على الخلايا. الخلايا العصبية هي الآن جاهزة للتحميل في الجهاز ميكروفلويديك الخلايا العصبية.

Protocol

إعداد E18 الخلايا العصبية الجنينية الجرذ القشرية للتجزئة

قبل البدء ، من المهم أن جميع وسائل الإعلام الدافئة والكواشف اللازمة إلى 37 درجة مئوية.

من المهم أيضا لتعقيم كل شيء يستخدم لتحضير الخلايا (على سبيل المثال ، والمصابيح والمطاط ، ورفوف أنبوب ، زجاجات وسائل الاعلام ، الخ) ، وأنه هو الذي وضعها في غطاء المحرك ، بواسطة المسح أسفل مع الايثانول 70 ٪.

1. مكان قطعتين من اللحاء E18 الفأر الجنينية (واحد من الدماغ ، وتشريح سابقا) في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من الجليد الباردة الخالية من الكالسيوم المغنيسيوم العازلة خالية تشريح.
2. إضافة 1 مل من 0.25 ٪ التربسين - EDTA إلى القشرة العازلة في التشريح ، ليصل إلى 2 الحجم النهائي والنهائي مل تركيز التربسين إلى 0.125 ٪.
3. وضع أنبوب 15 مل في 37 ° C حمام الماء لمدة 8 دقائق.
4. خلال هذا الوقت ، والحرائق تلميع الزجاج 3 pipets باستور ، وتشكيل فتحات صغيرة على التوالي ، في خزانة السلامة الأحيائية للمساعدة في الحفاظ العقم.
5. بعد 8 دقائق من الحضانة القشرة ، إضافة 10 مل من DMEM FBS تحتوي على 10 ٪ من القشرة للمساعدة على وقف تفاعل التربسين.
6. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل تحتوي على القشرة وDMEM/10 FBS ٪ في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
7. في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية ، وإزالة القشرة من طاف باستخدام الماصة باستور الزجاج مع شفط فراغ المرفقة. يجب الحرص على عدم إزعاج أو طرد بيليه.
8. إضافة 1 مل من NMB لبيليه والماصة القشرة بلطف صعودا وهبوطا. من المهم جدا لتجنب خلق فقاعات الهواء بينما pipeting صعودا وهبوطا ، وفقاعات الهواء يمكن أن تتلف الخلايا عن طريق الأكسدة.
9. استخدام النار مصقول الماصة باستور مع الانفتاح على أوسع نطاق متمزج القشرة عن طريق إرفاق لمبة المطاط عقيمة حتى النهاية وpipeting صعودا وهبوطا 5 مرات ، ومرة ​​أخرى والحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء. تستمر هذه العملية مع غيره من أنواع الزجاج pipets 2 ، مع كل انخفاض حجم فتح.
10. بعد سحن ، الطرد المركزي باستمرار خلايا مرة أخرى في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
11. بعد الطرد المركزي ، ومرة ​​أخرى وإزالة طاف resuspend الكرية خلية في 2 مل من مصرف مولدوفا الوطني.
12. تصفية خلية حل معلق من خلال مصفاة أم 45 خلية.
13. وصمة عار الخلايا مع التريبان الأزرق ، عدها ، وتحميلها إلى الأجهزة. نحن عادة تحميل 20 ماي من الخلايا في الجهاز.

ملاحظة : تركيز النهائي من الخلايا عادة ما بين 2.5 مليون خلية / مل والخلايا 8000000 / مل

تحميل الخلايا

بعد أن تم فرز الخلايا ، فقد حان الوقت لتحميل الخلايا في الجهاز :

1. جلب أجهزة معدة مسبقا تتضمن NBM الى مجلس الوزراء للحفاظ على سلامة الأحيائية العقم.
2. إزالة الزائدة وسائل الاعلام من الآبار عن طريق الشفط فراغ. ومع ذلك ، كن حذرا لتجنب إزالة كافة وسائل الإعلام -- يجب أن يكون هناك بعض وسائل الاعلام في القناة الرئيسية.
3. 20 تطبيق المجاهدين من الخلايا إلى خزان اليد اليسرى العلوي من الجهاز (انظر الرسم التخطيطي إذا لزم الأمر). تدفق الخلايا في الجهاز ، ونعلق على سطح PLL علاجها.
4. بعد التحميل ، ووضع الأجهزة التي تحتوي على خلايا مرة أخرى في حاضنة لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق.
5. بعد 10 دقيقة ، وملء الخزانات مع وسائل الإعلام والأجهزة المكان مرة أخرى في الحاضنة.

Discussion

يمكن أن تختلف تبعا لكثافة خلية التطبيق. ومع ذلك ، زرع الخلايا العصبية الأولية في منخفض جدا من كثافة يؤدي عادة إلى موت الخلية. اعتمادا على الحاضنة ومستوى الرطوبة ، وسائل الإعلام قد تحتاج إلى تغيير في الأجهزة كل يوم 2 إلى 3. عند تغيير وسائل الإعلام ، فمن المهم بعد إزالة وسائل الإعلام من الخزانات ، وأبدا لإزالة وسائل الاعلام من القنوات الرئيسية. علاوة على ذلك ، هو ممارسة جيدة لوضع وسائل الإعلام الجديدة في الآبار أعلى والسماح لبعض وسائل الإعلام الجديدة في التدفق من خلال الجهاز والى القنوات الرئيسية قبل ملء جميع الخزانات.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NBM	medium	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos	Animal			Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS	buffer			ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA	Reagent	Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets		Fisher Scientific		glass
DMEM	medium	Invitrogen
FBS	Reagent	Invitrogen		serum, used at 10% in DMEM
centrifuge				set at 2500 rpm
Trypan Blue		Invitrogen		for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um	Tool	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.