Biology

एक microfluidic डिवाइस में E18 Compartmentalization के लिए cortical चूहा न्यूरॉन्स की तैयारी

Published: October 1, 2007 doi: 10.3791/305

Joseph Harris¹, Hyuna Lee¹, Christina Tu Tu², David Cribbs³, Carl Cotman³, Noo Li Jeon¹

¹Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine (UCI), ²Stem Cell Research Center, University of California, Irvine (UCI), ³Institute for Brain Aging and Dementia, University of California, Irvine (UCI)

Summary

इस वीडियो में हम E18 cortical चूहा न्यूरॉन्स की तैयारी को प्रदर्शित करता है.

Abstract

इस वीडियो में, हम E18 cortical चूहा न्यूरॉन्स की तैयारी को प्रदर्शित करता है. E18 cortical चूहा न्यूरॉन्स E18 भ्रूण चूहे पहले dissected और तैयार प्रांतस्था से प्राप्त कर रहे हैं. E18 प्रांतस्था विच्छेदन पर उपलब्ध है, तुरंत व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में अलग है. यह संभव है सीतनिद्रा में होना ई 4 में B27 युक्त बफर ° सी में एक सप्ताह तक के लिए E18 प्रांतस्था पहले हदबंदी प्रदर्शन है दुकान. हालांकि, वहाँ सेल व्यवहार्यता में एक बूंद हो जाएगा. आमतौर पर हम हमारे E18 प्रांतस्था ताजा प्राप्त करते हैं. यह बर्फ के ठंडे कैल्शियम मुक्त मैगनीशियम मुक्त विच्छेदन बफर (CMFM) में प्रयोगशाला में ले जाया जाता है. आगमन पर, trypsin 0.125% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए प्रांतस्था के लिए जोड़ा जाता है. प्रांतस्था तो 8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated. 10% FBS युक्त DMEM प्रांतस्था करने के लिए जोड़ा जाता है की प्रतिक्रिया को रोकने के. प्रांतस्था तो 2 मिनट के लिए 2500 rpm पर centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और तंत्रिका बेसल मीडिया के 2 मिलीलीटर (NBM) 2 B27% (/ खंड खंड) और 0.25% Glutamax (खंड खंड /) प्रांतस्था है जो है तो फिर से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा निलंबित करने के लिए जोड़ा जाता है युक्त. अगले, प्रांतस्था पहले आग पॉलिश कांच लगातार छोटे खोलने के साथ, pipettes प्रत्येक के साथ है triturated है. Triturating के बाद, प्रांतस्था एक बार फिर 2 मिनट के लिए 2500 rpm पर centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला और फिर हटा दिया जाता है प्रांतस्था गोली NBM के 2 मिलीलीटर B27 और Glutamax युक्त के साथ फिर से निलंबित कर दिया. सेल निलंबन तो एक 40 उम नायलॉन सेल झरनी के माध्यम से पारित कर दिया है. अगला कोशिकाओं गिना रहे हैं. न्यूरॉन्स अब कर रहे हैं न्यूरॉन microfluidic डिवाइस में लोड करने के लिए तैयार है.

Protocol

E18 Compartmentalization के लिए भ्रूण चूहा cortical न्यूरॉन्स की तैयारी

बाहर शुरू करने से पहले, यह महत्वपूर्ण है कि 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सभी आवश्यक मीडिया अभिकर्मकों और गर्म

यह भी महत्वपूर्ण है सब कुछ है कि कोशिकाओं (जैसे, रबर बल्ब, ट्यूब रैक, मीडिया की बोतलें, आदि), और जो कि हुड में रखा गया है, 70% इथेनॉल के साथ नीचे पोंछते द्वारा तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है बाँझ.

एक 15 मिलीलीटर एक बहुत ठंडा मिलीलीटर मैगनीशियम मुक्त कैल्शियम मुक्त विच्छेदन बफर युक्त ट्यूब में E18 भ्रूण चूहा प्रांतस्था (एक मस्तिष्क, पहले dissected) के दो टुकड़े रखें.
विच्छेदन बफर में प्रांतस्था के लिए 0.25% trypsin - EDTA 1 मिलीलीटर जोड़ें, 2 मिलीलीटर और अंतिम trypsin 0.125% एकाग्रता के अंतिम मात्रा लाने.
8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 15 मिलीलीटर ट्यूब रखें.
इस समय के दौरान, आग पॉलिश 3 कांच पाश्चर pipets, क्रमिक छोटे उद्घाटन बाँझपन बनाए रखने में मदद के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में गठन.
प्रांतस्था का 8 मिनट ऊष्मायन के बाद, DMEM प्रांतस्था करने के लिए 10% FBS युक्त trypsin प्रतिक्रिया को रोकने में मदद के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
15 मिलीलीटर 2 मिनट के लिए 2500 rpm पर प्रांतस्था और DMEM/10% FBS युक्त ट्यूब अपकेंद्रित्र.
जैव सुरक्षा कैबिनेट में वैक्यूम चूषण संलग्न के साथ एक गिलास पाश्चर pipet का उपयोग प्रांतस्था से सतह पर तैरनेवाला हटायें. परेशान नहीं या गोली बेदखल करने के लिए सावधान रहें.
प्रांतस्था गोली और धीरे से ऊपर pipet और नीचे NMB के 1 मिलीलीटर जोड़ें. यह बहुत महत्वपूर्ण है जबकि pipeting और नीचे के रूप में हवाई बुलबुले ऑक्सीकरण द्वारा कोशिकाओं को नुकसान कर सकते हैं हवाई बुलबुले बनाने से बचने के.
व्यापक खोलने के साथ आग पॉलिश पाश्चर pipet प्रयोग को समाप्त करने के लिए एक बाँझ रबर बल्ब संलग्न और ऊपर और नीचे pipeting 5 बार प्रांतस्था triturate के, फिर से सावधान किया जा रहा शुरू करने के लिए हवाई बुलबुले नहीं. अन्य दो गिलास pipets के साथ इस प्रक्रिया को जारी रखें, एक कम खोलने के आकार के साथ प्रत्येक.
Trituration के बाद, नीचे 2 मिनट के लिए 2500 rpm पर फिर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र.
Centrifugation के बाद, एक बार फिर सतह पर तैरनेवाला हटाने और सेल गोली resuspend NBM के 2 मिलीलीटर में.
एक 45 उम सेल झरनी के माध्यम से resuspended सेल समाधान फ़िल्टर.
Trypan ब्लू, गिना, और उपकरणों में लोड के साथ कोशिकाओं का दाग. हम आम तौर पर प्रति युक्ति कक्षों की 20 उल लोड.

नोट: कक्षों की अंतिम एकाग्रता आमतौर पर 2.5 मिलियन कोशिकाओं / एमएल और 8 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के बीच

कोशिकाओं लोड हो रहा है

बाद कोशिकाओं गिना गया है, यह डिवाइस में कोशिकाओं को लोड करने के लिए समय है:

पहले से तैयार जैव सुरक्षा कैबिनेट में NBM युक्त बाँझपन बनाए रखने के उपकरणों लाओ.
कुओं से वैक्यूम चूषण द्वारा अतिरिक्त मीडिया निकालें. हालांकि, मीडिया के सभी हटाने से बचने के लिए सावधान हो - मुख्य चैनल में कुछ मीडिया होना चाहिए.
डिवाइस के शीर्ष बाएँ हाथ जलाशय कक्षों की 20 उल लागू करें (आरेख यदि आवश्यक देखें). डिवाइस में कोशिकाओं प्रवाह और PLL इलाज सतह के लिए देते हैं.
लोड करने के बाद, 10 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को वापस युक्त उपकरणों कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति जगह.
10 मिनट के बाद, मीडिया उपकरणों और जगह इनक्यूबेटर में वापस के साथ जलाशयों को भरने.

Discussion

सेल घनत्व आवेदन के आधार पर अलग किया जा सकता है. हालांकि, भी कम घनत्व के प्राथमिक न्यूरॉन्स बोने आम तौर पर कोशिका मृत्यु की ओर जाता है है. इनक्यूबेटर और नमी के स्तर पर निर्भर करता है, मीडिया के लिए हर 2 से 3 दिनों के उपकरणों में परिवर्तित किया जा आवश्यकता हो सकती है. जब बदलते मीडिया, जलाशयों से मीडिया को हटाने के बाद यह महत्वपूर्ण है, मुख्य चैनल से हटाने के लिए कभी नहीं मीडिया. इसके अलावा, यह अच्छा अभ्यास है शीर्ष कुओं में ताजा मीडिया जगह और कुछ ताजा मीडिया डिवाइस के माध्यम से और सभी जलाशयों को भरने से पहले मुख्य चैनल में प्रवाह करने के लिए अनुमति देते हैं.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NBM	medium	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos	Animal			Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS	buffer			ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA	Reagent	Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets		Fisher Scientific		glass
DMEM	medium	Invitrogen
FBS	Reagent	Invitrogen		serum, used at 10% in DMEM
centrifuge				set at 2500 rpm
Trypan Blue		Invitrogen		for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um	Tool	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.

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References

Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).