Summary
이 비디오에서는 E18 두피 랫 뉴런의 준비를 보여줍니다.
Abstract
이 비디오에서는, 우리는 대뇌 피질 E18 쥐 뉴런의 준비를 보여줍니다. E18 피질 쥐의 뉴런는 이전에 다음 ID로 해부하고 준비 E18 태아 쥐의 대뇌 피질에서 얻을 수 있습니다. E18의 피질 개별 뉴런에 즉시 dissociated, 절개시입니다. 그것은 해리가 수행되기 전에 최대 일주일까지 4 B27를 포함하는 최대 절전 E 버퍼 ° C에서 E18 피질을 저장할 수 있습니다. 그러나, 세포 생존에 드롭있을 것입니다. 일반적으로 우리 E18 접속 신선한를 구하십시오. 그것은 차가운 얼음 칼슘 마그네슘 무료 무료 해부 버퍼 (CMFM)에있는 실험실로 이송됩니다. 도착하자마자, 트립신은 0.125 %의 최종 농도 피질에 추가됩니다. 대뇌 피질은 다음 팔분에 대해 37 ° C에서 incubated입니다. 10% FBS를 포함한 DMEM는 반응을 막기 위해 피질에 추가됩니다. 대뇌 피질은 다음 2 분 동안 2,500 rpm으로 centrifuged입니다. 뜨는 제거하고 신경 기저 미디어 2 ML (NBM)는 2퍼센트 B27 (권 / 권)와 Glutamax (권 / 권)이 다음과 위아래로 pipetting하여 다시 중단되는 피질에 추가됩니다 0.25 %를 포함합니다. 다음 피질은 연속된 작은 오프닝과 함께 이전에 화재 광택 유리 pipettes, 각 triturated 있습니다. triturating 후, 피질은 다시 2 분 동안 2,500 rpm으로 centrifuged입니다. 뜨는 그런 다음 제거 피질 펠렛은 B27와 Glutamax을 포함 NBM 2 ML로 다시 일시 중지되었습니다. 세포 현탁액은 다음 40 음 나일론 셀 스트레이너를 통해 전달됩니다. 다음 세포가 계산됩니다. 뉴런은 이제 신경 microfluidic 장치에 로딩을위한 준비가되어 있습니다.
Protocol
Compartmentalization에 대한 E18 태아 쥐 두피 뉴런 준비
밖으로 시작하기 전에, 그것은 37 ° C.에 필요한 모든 미디어 및 시약을 따뜻하게하는 것이 중요합니다
70 % 에탄올로 닦고으로 후드에 배치하는 세포 (예, 고무 전구, 튜브 랙, 미디어 병 등), 그 준비에 사용되는 모든 소독하는 것도 중요하다.
- 1 ML 얼음처럼 차가운 칼슘 마그네슘 무료 무료 해부 버퍼를 포함하는 15 ML 튜브에 넣어 E18 태아 쥐의 피질의 두 가지 (한 두뇌 이전 해부)를.
- 2 ML 및 0.125 %로 최종 트립신 농도에 최종 볼륨을 가져, 해부 버퍼에있는 피질로 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML을 추가합니다.
- 팔분에 대해 37 ° C의 물을 욕조에 15 ML 튜브를 놓습니다.
- 이 기간 동안, 화재 폴란드어 3 유리 파스퇴르 pipets은 불임을 유지하기 위해 biosafety 캐비닛에 연속 작은 구멍을 형성.
- 피질의 8 분 부화 후 DMEM는 트립신 반응을 멈출 수 있도록 도와줘 피질 10 % FBS를 포함한 10 ML를 추가합니다.
- 2 분 동안 2,500 rpm으로 피질과 DMEM/10 % FBS를 포함한 15 ML 튜브를 원심 분리기.
- biosafety 캐비닛에서 진공 흡입 붙어있는 유리 파스퇴르 pipet을 사용하여 피질에서 뜨는을 제거하십시오. 방해 또는 펠렛을 이동시키다하지 않도록주의하십시오.
- 피질 펠렛 부드럽게 pipet 위아래로 NMB 1 ML을 추가합니다. 이것은 공기 거품이 산화하여 세포를 손상시킬 수 있으므로, 아래 pipeting 및하면서 공기 방울을 만드는 피하기 위해 매우 중요합니다.
- 끝까지 멸균 고무 벌브를 장착하고 5 번하고 아래로 pipeting하여 피질을 씹다 수있는 넓은 개방과 함께 불을 광택 파스퇴르 pipet을 사용하여 다시 신중하면 공기 방울을 소개하지 않습니다. 감소 오프닝 크기 각각 다른 두 유리 pipets이 과정을 계속합니다.
- 분쇄 후 2 분 동안 2,500 rpm으로 다시 세포를 원심 분리기.
- 원심 분리 후, 다시 뜨는을 제거하고 NBM 2 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- 45 음 셀 스트레이너를 통해 resuspended 세포 솔루션을 필터링합니다.
- 계산하고, 장치에 로드된 Trypan 블루와 세포를 얼룩. 우리는 일반적으로 장치마다 세포의 20 UL을로드합니다.
참고 : 세포의 최종 농도는 일반적으로 2,500,000 세포 / ML 및 8,000,000 세포 / ML 사이
세포를 로딩
세포가 계산되고 나면, 그것은 장치에있는 세포를 로드할 시간 :
- 불임을 유지하기 위해 biosafety 캐비닛에 NBM를 포함하는 이전에 준비 장치를 가져와.
- 진공 흡입하여 우물에서 여분의 미디어를 제거합니다. 그러나 미디어를 모두 제거하지 않도록주의 - 메인 채널의 일부 언론이 있어야합니다.
- (그림 필요한 경우 참조) 장치의 상단 왼쪽 저수지로 세포의 20 UL을 적용합니다. 세포의 장치에 흐름과 PLL 처리 표면에 첨부합니다.
- 로딩 후, 세포 부착 수 있도록 10 분 동안 인큐베이터에 다시 세포를 포함하는 장치를 놓으십시오.
- 십분 후에 다시 인큐베이터 미디어과 장소 장비와 저수지를 입력합니다.
Discussion
세포 밀도가 응용 프로그램에 따라 다양한하실 수 있습니다. 그러나 밀도가 너무 낮아에서 기본 뉴런을 심는 것은 일반적으로 세포 사망에 이르게한다. 인큐베이터와 습도의 수준에 따라, 미디어 장치마다 2~3일 변화해야 할 수 있습니다. 미디어를 변경하면, 그것은 주요 채널에서 미디어를 제거하지 않는다는, 저수지에서 미디어를 제거한 후에 중요합니다. 더 나아가, 그것은 최고 우물에 신선한 미디어를 장소와 신선한 미디어의 모든 저수지를 작성하기 전에 장치를 통해 주요 채널로 흘러 수 있도록하는 것이 좋습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
