Summary
Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation de la E18 neurones de rat corticale.
Abstract
Dans cette vidéo, nous démontrons la préparation de la E18 neurones de rat corticale. E18 neurones corticaux de rat sont obtenus à partir de cortex de rat fœtal E18 précédemment disséqué et préparé. Le cortex E18 est, à la dissection, immédiatement dissocié en neurones individuels. Il est possible de stocker E18 cortex dans Hibernate tampon E contenant B27 à 4 ° C jusqu'à une semaine avant la dissociation est réalisée. Cependant, il y aura une baisse de la viabilité cellulaire. Généralement, nous obtenons de nos frais E18 Cortex. Il est transporté au laboratoire dans la glace de calcium libre tampon froid de dissection magnésium libre (CMFM). À l'arrivée, la trypsine est ajoutée au cortex à une concentration finale de 0,125%. Le cortex est ensuite incubée à 37 ° C pendant 8 minutes. FBS DMEM contenant 10% est ajouté au cortex pour arrêter la réaction. Le cortex est ensuite centrifugé à 2500 rpm pendant 2 minutes. Le surnageant est éliminé et 2 ml de milieux de base neurale (NBM) contenant 2% de B27 (vol / vol) et 0,25% Glutamax (vol / vol) est ajouté au cortex, qui est ensuite remis en suspension par aspiration et refoulement. Ensuite, le cortex est trituré avec des pipettes en verre poli au feu précédemment, chacun avec une petite ouverture successive. Après trituration, le cortex est de nouveau centrifugé à 2500 rpm pendant 2 minutes. Le surnageant est alors éliminé et le culot remis en suspension du cortex avec 2 ml de NBM contenant B27 et Glutamax. La suspension cellulaire est ensuite passé à travers un tamis en nylon 40 cellules um. Suivant les cellules sont comptées. Les neurones sont maintenant prêts à charger dans l'appareil neurone microfluidique.
Protocol
Préparation des neurones de rat fœtal E18 corticales pour compartimentation
Avant de commencer, il est important de réchauffer tous les médias et les réactifs nécessaires à 37 ° C.
Il est également important de stériliser tout ce qui est utilisé pour la préparation des cellules (par exemple, les ampoules de caoutchouc, supports pour tubes, des bouteilles médias, etc), et celui qui est placé dans la hotte, en essuyant avec de l'éthanol à 70%.
- Placez deux morceaux de cortex de rat fœtal E18 (un cerveau, précédemment disséqué) dans un tube de 15 ml contenant 1 ml glacée sans calcium magnésium tampon sans dissection.
- Ajouter 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA au cortex dans le tampon de la dissection, portant le volume final de 2 ml et la concentration de trypsine finale à 0,125%.
- Placez le tube de 15 ml dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 8 minutes.
- Pendant ce temps, le feu polonaise de verre 3 pipettes Pasteur, formant des ouvertures plus petites successivement, dans une enceinte de biosécurité pour aider à maintenir la stérilité.
- Après l'incubation 8 minutes du cortex, ajouter 10 ml de DMEM contenant 10% de FBS au cortex pour aider à arrêter la réaction trypsine.
- Centrifuger le tube de 15 ml contenant du cortex et DMEM/10% de FBS à 2500 rpm pendant 2 minutes.
- Dans le cabinet de biosécurité, éliminer le surnageant du cortex en utilisant une pipette Pasteur en verre avec des ventouses ci-joint. Soyez prudent de ne pas déranger ou déloger le culot.
- Ajouter 1 ml de NMB à la pastille cortex et délicatement la pipette de haut en bas. Il est très important pour éviter de créer des bulles d'air tout en haut et en bas de pipetage, comme les bulles d'air peuvent endommager les cellules par oxydation.
- Utilisez le feu poli pipette Pasteur avec la plus large ouverture de triturer le cortex en attachant une poire en caoutchouc stériles jusqu'à la fin et pipetage haut et en bas 5 fois, encore une fois en faisant attention à ne pas introduire de bulles d'air. Continuez ce processus avec les 2 autres pipettes en verre, chacun avec une taille d'ouverture diminué.
- Après trituration, centrifuger le bas des cellules de nouveau à 2500 rpm pendant 2 minutes.
- Après centrifugation, une fois de retirer le surnageant et remettre le culot cellulaire dans 2 ml de MNB.
- Filtrer la solution de cellules en suspension à travers un tamis 45 cellules um.
- Colorer les cellules au bleu trypan, compté, et chargé dans les appareils. En général, nous charge de 20 ul de cellules par l'appareil.
Remarque: la concentration finale de cellules est typiquement comprise entre 2,5 millions de cellules / ml et 8 millions de cellules / ml
Chargement des cellules
Après que les cellules ont été comptées, il est temps de charger les cellules de l'appareil:
- Apportez les dispositifs précédemment préparés contenant MNB dans l'armoire de biosécurité afin de maintenir la stérilité.
- Retirer l'excès des médias provenant des puits par aspiration sous vide. Cependant, soyez prudent pour éviter d'enlever tous les médias - il doit y avoir certains médias dans le chenal principal.
- Appliquer 20 ul de cellules dans le réservoir en haut à gauche de l'appareil (voir schéma si nécessaire). Le flux de cellules dans l'appareil et fixer à la surface traitée PLL.
- Après le chargement, placer les appareils contenant des cellules de retour dans un incubateur pendant 10 minutes pour permettre aux cellules d'attacher.
- Après 10 minutes, remplir les réservoirs avec les médias et les dispositifs replacer dans l'incubateur.
Discussion
Densités cellulaires peuvent être variés en fonction de la demande. Toutefois, l'ensemencement des neurones primaires à trop basse d'une densité entraîne généralement la mort cellulaire. Selon l'incubateur et le niveau d'humidité, les médias peuvent avoir besoin d'être changé dans les appareils tous les 2 à 3 jours. Lors du changement de support, il est important après la suppression des médias à partir des réservoirs, de ne jamais retirer le support des canaux principaux. En outre, il est conseillé de placer des milieux frais dans le puits supérieur et permettre à certains milieux frais de circuler à travers l'appareil et dans les principaux canaux avant de remplir tous les réservoirs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
