Summary
In diesem Video zeigen wir die Herstellung von E18 Kortikale Rattenneuronen.
Abstract
In diesem Video zeigen wir die Herstellung von E18 kortikalen Rattenneuronen. E18 kortikalen Rattenneuronen sind von E18 fetalen Rattencortex vorher seziert und hergestellt wurde. Das E18 Kortex ist, auf Dissektion, sofort dissoziiert in einzelnen Neuronen. Es ist möglich, E18 Kortex in Hibernate E-Puffer mit B27 bei 4 ° C lagern bis zu eine Woche vor der Dissoziation durchgeführt wird. Allerdings wird es ein Tropfen auf die Lebensfähigkeit der Zellen sein. In der Regel erhalten wir unsere E18 Cortex frisch. Es ist das Labor in eiskaltem Calcium frei Magnesium frei Dissektion Puffer (CMFM) transportiert. Bei der Ankunft ist Trypsin auf die Hirnrinde auf eine Endkonzentration von 0,125% aufgenommen. Die Rinde ist dann bei 37 ° C für 8 Minuten inkubiert. DMEM mit 10% FBS auf die Hirnrinde hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Die Rinde wird dann bei 2500 rpm für 2 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und 2 ml Neural Basal Media (NBM) mit 2% B27 (vol / vol) und 0,25% Glutamax (vol / vol) die Hirnrinde, die dann durch Auf-und Abpipettieren resuspendiert hinzugefügt wird. Anschließend wird die Rinde mit den zuvor feuerpolierte Glaspipetten, die jeweils mit einer sukzessiven kleinere Öffnung verrieben. Nach Verreiben wird der Kortex wieder bei 2500 rpm für 2 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird dann entfernt und die Rinde Pellet mit 2 ml NBM mit B27 und Glutamax resuspendiert. Die Zellsuspension wird dann durch einen 40 um Nylon Zellsieb weitergegeben. Anschließend werden die Zellen gezählt. Die Neuronen sind nun bereit zum Laden in das Neuron Mikrofluidikvorrichtung.
Protocol
Vorbereitung E18 Fetal Rat kortikalen Neuronen für Kompartimentierung
Vor dem Losfahren ist es wichtig, alle notwendigen Medien und Reagenzien auf 37 ° C warmen
Es ist auch wichtig, dass alles, was für die Vorbereitung der Zellen (z. B. Gummi Glühbirnen, Reagenzglasgestelle, Medien-Flaschen, etc.), und das, was in der Motorhaube platziert ist, durch Abwischen mit 70% Ethanol verwendet wird sterilisieren.
- Legen Sie zwei Stück E18 Fetal Rat Cortex (ein Gehirn, vorher zerlegt) in einem 15 ml Röhrchen mit 1 ml eiskaltem Calcium-freien Magnesium-freie Präparation Puffer.
- 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA auf die Hirnrinde in Dissektion Puffer, wodurch die endgültige Volumen auf 2 ml und letzte Trypsin-Konzentration auf 0,125%.
- Legen Sie die 15 ml Tube in einem 37 ° C Wasserbad für 8 Minuten.
- Während dieser Zeit bildet Feuer polish 3 Glas Pasteur Pipetten, immer kleinere Öffnungen, in einem Biosicherheitswerkbank zu helfen, der Aufrechterhaltung der Sterilität.
- Nach dem 8 Minuten Inkubation des Kortex, 10 ml DMEM mit 10% FBS auf die Großhirnrinde zu helfen, die Trypsin-Reaktion.
- Zentrifugieren Sie die 15 ml Tube mit der Rinde und DMEM/10% FBS bei 2500 rpm für 2 Minuten.
- In der Biosicherheitswerkbank, entfernen Sie den Überstand aus der Rinde mit einem Glas Pasteur-Pipette mit Vakuum angesaugt. Achten Sie darauf, nicht zu stören oder zu vertreiben die Pellets.
- 1 ml der NMB zum Kortex Pellet und sanft Pipette auf und ab. Es ist sehr wichtig, damit Sie keine Luftblasen während Pipettieren auf und ab, wie die Luftblasen können die Zellen durch Oxidation beschädigt.
- Verwenden Sie die feuerpolierte Pasteur-Pipette mit dem breitesten Öffnung der Hirnrinde durch die Anbringung eines sterilen Gummiball bis zum Ende und Pipettieren nach oben und unten 5 Mal verreiben, wieder darauf achten, daß einführen Luftblasen. Setzen Sie diesen Vorgang mit den anderen 2 Glas Pipetten, jeweils mit einer verringerten Öffnung Größe.
- Nach Anreiben Zentrifuge bis die Zellen wieder bei 2500 rpm für 2 Minuten.
- Nach der Zentrifugation erneut den Überstand und Zellpellet in 2 ml NBM.
- Filter der resuspendierten Zellen-Lösung durch ein 45 um Zellsieb.
- Stain die Zellen mit Trypanblau, gezählt und geladen in die Geräte. Wir laden normalerweise 20 ul der Zellen pro Gerät.
Hinweis: Die Endkonzentration der Zellen ist in der Regel zwischen 2,5 Mio. Zellen / ml und 8 Millionen Zellen / ml
Das Laden der Zellen
Nachdem die Zellen gezählt wurden, ist es Zeit, um die Zellen in das Gerät zu laden:
- Bringen Sie die zuvor hergestellte Geräte mit NBM in die Biosicherheitswerkbank, um die Sterilität zu erhalten.
- Entfernen Sie überschüssige Medien aus den Vertiefungen durch Vakuum abgesaugt. Seien Sie jedoch vorsichtig, um zu vermeiden Entfernen aller der Medien - es muss einige Medien in den Hauptkanal werden.
- Übernehmen 20 ul der Zellen auf der oberen linken Reservoir des Gerätes (siehe Diagramm falls erforderlich). Die Zellen fließen in das Gerät und befestigen Sie die PLL behandelten Oberfläche.
- Nach dem Laden, setzen Sie die Geräte mit mehreren Zellen wieder in einen Inkubator für 10 Minuten, damit sich die Zellen zu verbinden.
- Nach 10 Minuten füllen die Stauseen mit Medien und Geräten Platz zurück in den Inkubator.
Discussion
Zelldichten kann variiert je nach Anwendung werden. Allerdings Aussaat primären Neuronen zu niedrig mit einer Dichte von typischerweise zum Zelltod führt. Je nach dem Inkubator und die Höhe der Luftfeuchtigkeit können Medien benötigen, um in die Geräte alle 2-3 Tage gewechselt werden. Beim Wechsel Medien ist es nach dem Entfernen der Medien aus den Stauseen wichtig, nie zu entfernen Medien aus der Hauptkanäle. Außerdem ist es ratsam, frisches Medium in der oberen Brunnen Platz und erlauben frische Medien durch das Gerät und in die Hauptkanäle vor der Abfüllung bis alle Stauseen fließen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
