Summary
Bu video E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlık göstermektedir.
Abstract
Bu video, E18 kortikal sıçan nöronların hazırlık göstermektedir. E18 kortikal sıçan nöronlar önceden disseke ve hazırlanan E18 fetal sıçan korteks elde edilir. E18 korteks bireysel nöronlar içine hemen ayrışmış, diseksiyon üzerine. Bu ayrışma yapmadan önce bir hafta için 4 B27 içeren Hazırda Bekleme E tampon ° C korteks E18 saklamak mümkündür. Ancak, hücre canlılığı bir düşüş olacaktır. Genelde bizim E18 Cortex taze edinin. Bu buz Kalsiyum Magnezyum ücretsiz diseksiyonu tamponu (CMFM) laboratuarına sevk edilir. Varışta, tripsin,% 0.125 final konsantrasyonu korteks eklenir. Korteks, 8 dakika sonra 37 ° C'de inkübe edilir. % 10 FBS içeren DMEM reaksiyonu durdurmak için korteks eklenir. Korteks daha sonra 2 dakika süreyle 2500 rpm'de santrifüj edilir. Süpernatant kaldırılır ve Sinir Bazal Medya 2 ml (NBM)% 2 B27 (hacim / hacim) ve% 0.25 'Glutamax (hacim / hacim), sonra yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yeniden askıya kortekse eklenir içeren. Ardından, korteks ardışık küçük açılması ile daha önce yangın parlatılmış cam pipetler, her triturated. Triturating sonra, korteks yine 2 dakika boyunca 2500 rpm'de santrifüj edilir. Süpernatant sonra kaldırılır ve korteks pelet B27 ve Glutamax içeren NBM 2 ml ile tekrar askıya. Hücre süspansiyonu daha sonra 40 um naylon hücre süzgecinden geçirilir. Sonraki hücreler sayılır. Nöronlar, nöron mikroakışkan cihaza yüklenmesi için artık hazır.
Protocol
Compartmentalization E18 Fetal Sıçan Kortikal nöronlar hazırlanması
Başlamadan önce, gerekli tüm medya ve reaktifler 37 ° C'ye kadar ısıtmak için önemlidir.
% 70 etanol ile silerek, kaput yerleştirilir hücreleri (örneğin, kauçuk ampuller, boru rafları, medya şişeleri, vb), ve hazırlanması için kullanılan her şeyi sterilize etmek için de önemlidir.
- E18 Fetal Sıçan Korteks iki adet (biri beyin, daha önce disseke) 1 ml buz Kalsiyum Magnezyum ücretsiz diseksiyonu tampon içeren 15 ml tüp yerleştirin.
- Son hacmi 2 ml ve% 0.125 'son tripsin konsantrasyon getirerek, diseksiyon tamponunda kortekse 1 ml% 0.25' lik tripsin-EDTA ekleyin.
- 8 dakika 37 ° C su banyosunda 15 ml tüp yerleştirin.
- Bu süre zarfında, yangın cilası 3 su bardağı Pasteur pipetler, kısırlık korumaya yardımcı olmak için bir biyogüvenlik kabini, gittikçe daha küçük açıklıklar oluşturan.
- Korteksin 8 dakika inkübasyondan sonra, DMEM korteks tripsin reaksiyon durdurmaya yardımcı olmak için% 10 FBS içeren 10 ml ekleyin.
- 2 dakika süreyle 2500 rpm'de korteks ve DMEM/10% FBS içeren 15 ml tüp santrifüjleyin.
- Biyogüvenlik kabini, vakum emme eklenmiş bir bardak yeniden süspanse kullanarak korteks süpernatant kaldırmak. Rahatsız ya da pelet çıkarmak için dikkatli olun.
- NMB 1 ml korteks pelet ve hafifçe pipetlemeyin yukarı ve aşağı ekleyin. Bu hava kabarcıkları oksidasyonu ile hücrelere zarar verebilir gibi, aşağı yukarı pipeting sırasında hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için çok önemlidir.
- Sonuna kadar steril bir kauçuk ampul takmak ve 5 kat yukarı ve aşağı pipeting korteks çiğnemek geniş açılması ile yangın cilalı yeniden süspanse kullanın, yine dikkatli olmak hava kabarcıkları tanıtmak değil. Her bir azalma açılış boyutu ile, diğer 2 cam pipetler ile bu işleme devam edin.
- Öğütme sonra 2 dakika süreyle 2500 rpm'de hücreleri tekrar santrifüj.
- Santrifüj sonra, bir kez daha süpernatantı kaldırmak ve NBM 2 ml hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.
- 45 um hücre süzgecinden yeniden süspanse hücre çözümü Filtresi.
- Sayılır ve cihazlar içine yüklenen Tripan Mavi, hücrelerin Leke. Biz genellikle cihaz başına 20 ul hücrelerinin yükleyin.
Not: hücrelerin nihai konsantrasyonu tipik olarak 2,5 milyon hücre / ml ve 8 milyon hücre / ml arasında
Hücrelerin yükleniyor
Hücreler sayılır edildikten sonra, cihaz hücreleri yük zamanı:
- Kısırlık korumak için biyogüvenlik kabini içine NBM içeren önceden hazırlanmış cihazlar getirin.
- Vakum emiş kuyularından aşırı ortamı çıkarın. Ancak, tüm medya kaldırarak önlemek için dikkatli olmak, ana kanal bazı medya olması gerekir.
- (Diyagram gerekirse bakınız) hücrelerin 20 ul cihazın sol üst rezervuar uygulayın. Hücreleri cihazın içine akışı ve PLL tedavi yüzey eklemek.
- Yükledikten sonra, bir kuluçka hücreleri takmak için izin vermek için 10 dakika geri hücreleri içeren cihazlar yerleştirmek.
- 10 dakika sonra geri inkübatör medya ve yer cihazlar rezervuarları doldurun.
Discussion
Hücre yoğunlukları uygulamaya bağlı olarak çeşitli olabilir. Ancak, çok düşük bir yoğunluğu birinci nöron ekim genellikle hücre ölümüne yol açar. Inkübatör ve nem düzeyine bağlı olarak, medya cihazları her 2-3 günde değişti gerekebilir. Ortamı değiştirirken, ana kanal medya kaldırmak asla rezervuarları medya çıkardıktan sonra önemlidir. Bunun yanı sıra, taze medya üst kuyular yerleştirin ve tüm rezervuarlar doldurmadan önce cihaz üzerinden ve ana kanal içine biraz taze medya akışını sağlamak için iyi bir uygulamadır.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
