Summary
Этот протокол описывает метод изображения флуоресцентного Т-клетки вводятся в лимфатические узлы ломтиками. Техника позволяет в режиме реального времени анализ миграции Т-клеток с традиционными широкопольных флуоресценции или конфокальной микроскопии.
Abstract
Наивные Т-клетки непрерывно трафик на вторичных лимфоидных органах, в том числе периферических лимфатических узлов, для выявления редких выразил антигенов. Миграцию Т-клеток в лимфатические узлы является сложным процессом, который включает как сотовая и химических факторов, включая хемокинов. В последнее время использование двух-фотонной микроскопии позволило отслеживать Т-клеток в интактных лимфатических узлов и получить некоторые количественные данные об их поведении и их взаимодействие с другими клетками. Хотя Есть очевидные преимущества в системе естественных условиях, этот подход требует сложных и дорогостоящих приборов и обеспечивает ограниченный доступ к ткани. Для анализа поведения Т-клеток в мышиный лимфатических узлов, мы разработали срез анализа 1, первоначально созданная нейробиологов и транспонированной недавно мышиного тимуса 2. В этой технике, флуоресцентно меченных Т-клетки высевают на вершине остро подготовлена часть лимфатических узлов. В этом видео-статьи, локализации и миграции Т-клеток в ткани, анализируются в режиме реального времени с широкопольных и конфокальной микроскопии. Техника, которая дополняет в естественных условиях двухфотонного микроскопии предлагает эффективный подход к изображению Т-клеток в их естественной среде и выяснить механизмы, лежащие Т-клеток миграции.
Protocol
1. Подготовка ломтики из лимфатических узлов
- Подготовка 4% низкой температурой плавления агарозы решение для вложения. Развести агарозы в ФБР и СВЧ этого решения. Когда агарозном полностью растворяется, поддерживать решения при 37 ° С до готовности к использованию.
- Подготовка 6-и культуре ткани пластины. Добавить 1,1 мл полной среды RPMI культуры на лунку, и вставьте органотипической фильтр в каждую лунку. Место 6-луночный планшет при 4 ° С до готовности передать ломтиками.
- Место шайб из нержавеющей стали, с внутренним диаметром 4 мм, в пластиковых блюдо заполнено RPMI полной среде. Шайбы будут в дальнейшем использоваться для концентрации клеток на vibratome часть разреза.
- Жертва мыши в соответствии с местными правилами содержания животных. Осторожно снимите периферических лимфатических узлов от окружающей ткани и поместите их в пластиковый блюдо с ледяным PBS. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить структуру лимфатических узлов, так как эти органы очень мягкий.
- Залить 4%-ном агарозном геле в 35-мм пластиковые тарелки и деликатно передачи узлов в гель. Оставьте агарозном геле на льду в течение 5 мин, чтобы укрепиться.
- Удалить блок из тарелки и отделка агар, чтобы оставить 3-5 мм геля вокруг каждого лимфатических узлов.
- Прикрепить вложенных узлов на образец диска vibratome с использованием нетоксичных ткань клеем. Установить образец диска в лотке со льдом, холодной PBS.
- Раздел агар-встроенные ткани на 320 мкм толщины с vibratome скорости установлен на медленном диапазоне (0,3 мм / с) и частоту колебаний установлен на средней дистанции (1,5 мм).
- Тщательно передачи ломтиками лимфатических узлов, как они сокращаются на органотипической вставками культуры с использованием тонких щипцов. Место 3 ломтика на каждой вставки. Использование большой осторожностью, как ломтики могут быть легко повреждены. Типичный периферических лимфатических узлов даст 5 секций при разрезании на 320 мкм. Откажитесь от первого и последнего ломтиками, так как они содержат только поверхностные ткани.
- Место шайб из нержавеющей стали на каждом отдельном срезе. Убедитесь в том, шайбы, хорошо позиционируется на агарозном окружающие ткани.
- Инкубируйте культуру пластины при температуре 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора увлажненный до готовности пластины Т-клеток.
2. Изоляция Т-клеток от мышей лимфатических узлов
- Изолировать Т-клеток в соответствии с ранее опубликованной статье Юпитер 3.
- Использование Т-клетки сразу и переходите к следующему разделу. В противном случае, лимфоциты могут быть культурным ночь в полной RPMI-среде с добавлением 10 нг / мл ИЛ-7.
3. Маркировка изолированных Т-клетки
- Вымойте клеток в HBSS. Ресуспендируют их в том же буфере при 10 х 10 6 на мл.
- Добавить такой же объем HBSS, содержащей 1 мкМ сотовый Tracker зеленый CMFDA давая конечной концентрации 0,5 мкМ.
- Инкубируйте клеточной суспензии при температуре 37 ° С в течение 5 мин. Вымойте клетки в два раза с полной RPMI-среде.
- Ресуспендируют клеток в конечной концентрации 10 х 10 6 на мл в полной RPMI-среде. Эти меченые клетки будут покрыты на ломтики.
Другие флуоресцентных красителей, чем CMFDA может быть использован тоже, но имейте в виду, что эти молекулы являются потенциально токсичными выше определенных концентраций.
4. Покрытие помечены Т-клеток на ломтики лимфатических узлов
- Удалите излишки средой, содержащиеся в внутренней части шайбы с пипеткой. Не позволяйте ткани становятся сухими, работают быстро на этом этапе.
- Аккуратно обойтись от 10 до 20 мкл меченых Т-клеток, что соответствует 1 до 2 х 10 5 клеток на внутренней части стиральной машины. Необходимо соблюдать осторожность и не прикасайтесь к ткани с кончика пипетки. Будьте уверены, что капля суспензии клеток остается на месте.
- Место срезов клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 в течение 30 мин, чтобы лимфоциты мигрируют в ткани.
5. Изображений Т-клеток в лимфатических узлах ломтиками
В этом видео-статьи, мы флуоресцентные изображения Т-клеток в лимфатических узлах ломтики широкопольных инвертированного микроскопа и конфокальной прямой микроскоп.
- Установите температуру на 37 ° C. Наши микроскопы оснащены регулируемой температурой камеры.
- Установить перфузии система, позволяющая непрерывной перфузии ломтик лимфатических узлов с кислородом (5% CO 2, 95% O 2) фенола красного среде без RPMI. В нашей системе перфузии СМИ входит в изображение камеры с одной стороны, под действием силы тяжести. Среды атмосферный с насос, подключенный к колбе сбора отходов. Установите частоту рабочих сред до 1 мл / мин.
- С тонкой пинцетом, осторожно вынуть часть из 6-луночного планшета и падения подготовки в подогретом кислородом RPMI среду в течение нескольких секунд, чтобы избавиться от флуоресцентных клетки не проникла в ткань.
ИмаГинг Т-клеток с широким полем инвертированного микроскопа
- Место среза вверх тормашками на заказ изображений камеру, которая состоит из нейлона темы наклеиваются на внутреннюю часть блюдо стеклянным дном. В этой камере, нейлон темы поднять часть из стекла и позволяют кислородом решение диффундируют в ткани. Это необходимо, как Т-клеток миграции в лимфатические узлы сильно зависит от кислорода. Безопасные срез, добавив на него шайбу из нержавеющей стали. В этих условиях часть лежит несколько микрон над дном тарелку, которая способствует обновлению перфузии раствором.
- Чтобы захватить большое поле зрения (800 х 800 мкм, примерно треть срез поверхности узла), собирать изображения, используя 10-кратный объектив сухой. Мы обнаружили, что 10-кратный Nikon S фтора 0,5 Н.А. была наиболее подходящей для нашего анализа.
Типичный покадровой визуализации эксперимент захватывает 5 оптических самолетов охватывающей общей глубиной 50 мкм в осевом (г) измерение. Флуоресцентные Т-клетки, как правило, отображаемого с интервалами от 10 до 30 секунд, в течение от 10 до 20 мин.
Изображений Т-клеток с конфокальной прямой микроскоп
Конфокальной микроскопии, используемые в настоящем протокол Leica SP5 оснащена 20-кратным погружения в воду цель (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Безопасные квант изображения столик микроскопа. Примечание: Мы обычно помещают шайбу на подготовку, чтобы обездвижить его.
- Установить изображений сессии, собирая серии изображений по оси. Чтобы создать образ Т-клеток в нетронутой структуру ткани, исходное положение, как правило, установлен на уровне от 5 до 10 мкм ниже первого помечены Т-клеток.
6. Представитель результаты
Следуя этой видео-протокол, который вы должны ожидать, чтобы визуализировать большое количество Т-клеток, люминесцентные, накопленных в Т зоне узла, явление, которое обычно происходит в этой конкретной среды в естественных условиях (рис. 1). В частности, Т-клетки должны быть исключены из зоны B клетки, которые обычно как раз под капсулой. Успешный эксперимент также приведет к Т-клетки призыву в ткани (рис. 2), показывая очень подвижны поведения (рис. 3) в соответствии с опубликованными результатами, полученные в нетронутой лимфатических узлов 4. В среднем, средняя скорость отдельных Т-клеток в ломтиков должна быть близка к 10 мкм / мин (рис. 4).
Рисунок 1. Т-клетки накапливаются в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клеток (CMFDA, зеленый) были добавлены к ломтик лимфатических узлов за 30 минут до получения изображения (верхний рисунок). Изображение максимальный выступ 5 изображений охватывающих 50 мкм в направлении оси Z.. Яркий образ поля приведена на дно. Изображения были захвачены с помощью микроскопа широкопольных.
Рисунок 2. Т-клетки вербуют в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клеток (CMFDA, зеленый) были добавлены к ломтик лимфатических узлов за 30 минут до получения изображения использованием конфокальной микроскопии. Изображения были захвачены на поверхности разреза (верхний рисунок) и 40 мкм ниже (нижний рисунок).
Рисунок 3. Т-клетки чрезвычайно подвижны в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клетки были обследованы в течение 12 мин с использованием микроскопа широкопольных. Траектории отдельных клеток Т отображаются в виде цветных треков представляют увеличения смещения от синего (низкая подвижных клеток) до красного (высокий подвижных клеток). Треки были рассчитаны с использованием Imaris программного обеспечения. Белая линия следующим край узла, в то время как пунктирные овальной разграничивает зоны предполагаемого клеток.
Рисунок 4. В ломтик лимфатических узлов, скорость Т-клеток, близка к 10 мкм / мин. Скорости были рассчитаны с использованием программного обеспечения от Imaris треки представлены на рисунке 3.
Discussion
Мы описали простой, быстрый и надежный способ для генерации лимфатических узлов ломтиками, которые используются для исследования поведения введен Т-клеток. В последние годы этот метод был успешно применен использованием тимуса и кусочками лимфатических узлов для определения внеклеточных факторов, контролирующих Т позиционирования клетки и подвижность 1,5. Он также был использован для измерения Са 2 + ответов в тимоцитов при положительном отборе и в Т-клетках после распознавания антигена 2,6. Анализ наложения срез представляет преимущества и ограничения, которые заслуживают того, чтобы обсуждать. Следует отметить, что эта система обеспечивает доступ к ткани, полезно, если нужно манипулировать ломтиками фармакологически для того, чтобы вмешиваться в молекулярный контроль миграции клеток. После обработки изображений, ломтики могут быть обработаны для иммуногистохимии для сбора дополнительной информации о структурах, которые были в образ. Более того, наблюдения могут быть сделаны с традиционными микроскоп флуоресценции широкопольных. Хотя резолюция не так хорошо, как с конфокальной или двухфотонного микроскопа и фототоксичности, что, в принципе, более серьезные с однофотонной, чем с двухфотонной микроскопии, она имеет преимущества простоты, низкой стоимости, и более широкого выбора возбуждения волн.
Изображений Т-клеток в здоровом лимфатических узлов требует внутривенного введения меченых лимфоцитов, которые впоследствии домой лимфоидных органах. Как было показано ранее 1, часть анализа вполне совместим с приемными эксперимент перевода. Тем не менее, время, необходимое для Т-клеток на главную в лимфатические узлы могут осложнить использование флуоресцентных красителей, которые имеют тенденцию к утечке из клеток с течением времени. Это случай Са 2 + краситель Фура-2. С быстрым набора (<30 мин) Т-клеток в ткани, срез анализа дает возможность использовать такие красители. Наконец, этот метод имеет большое преимущество для анализа Т клеточных функций в некоторых тканях человека оставлял в живых.
Эта экспериментальная система представляет также ограничения, которые необходимо иметь в виду. Повреждения, связанные с нарезки может повлиять T функционирования клеток, особенно в области поверхностных тканей вблизи поверхности среза. Для того чтобы оценить гибели клеток в срезе, мы использовали флуоресцентный краситель SYTOX зеленый, который проникает клетки с ослабленной плазматической мембраны. Наши эксперименты показывают, что около 20% от общего числа клеток узловой, в основном локализована в области поверхностных тканей, были помечены флуоресцентно этого ядерного красителя. Другая потенциальная проблема с анализа является способность ломтиками сохранить важные растворимых факторов, включая хемокинов. Хотя, у нас нет никаких признаков того, что наши данные были затронуты такие проблемы, так как Т-клетки дисплей хорошей подвижности в ломтик, мы хотели бы подчеркнуть важность изображений Т-клеток у здоровых регионов, расположенных в несколько десятков микрон от поверхности среза. Принимая во внимание, это может быть сделано с традиционными микроскопы (широкопольных или конфокальной), как в этот протокол, вполне вероятно, что часть лимфатического узла подготовки в сочетании с двухфотонного изображения увеличится пространственное разрешение по глубине и снижения фототоксичности.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Ален Траутманн, который призвал нас провести ломтиками лимфатических узлов. Эта работа была частично поддержана грантами от Национальной лиги Contre ле Рак, Фонд залить La Recherche Medicale ан Франции и Ассоциацией залить La Recherche сюр-ле-Рака.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | Any Supplier | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
References
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. , (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
