Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att bilden fluorescerande T-cellerna förs in skivor lymfkörtel. Tekniken möjliggör realtid analyser av T-cell migration med traditionella widefield fluorescens eller konfokala mikroskop.
Abstract
Naiva T-celler trafiken kontinuerligt till sekundära lymfoida organ, inklusive perifera lymfkörtlar, för att upptäcka ovanliga uttryck antigener. Migreringen av T-celler i lymfkörtlar är en komplex process som inbegriper både cellulär och kemiska faktorer, inklusive kemokiner. Nyligen har användningen av två-photon mikroskopi tillåtet att spåra T-celler i intakta lymfkörtlarna och att härleda vissa kvantitativa uppgifter om deras beteende och deras interaktioner med andra celler. Även om det finns uppenbara fördelar med att en in vivo-system, kräver denna metod en komplicerad och kostsam instrumentering och ger begränsad tillgång till vävnaden. För att analysera beteendet hos T-celler i murina lymfkörtlar, har vi utvecklat en bit analys 1, som ursprungligen inrättades genom neurobiologists och införlivade nyligen mot murina bräss 2. Genom denna teknik är fluorescerande T-cellerna pläterade på toppen av en akut beredd lymfkörtel skiva. I denna video-artikeln, är lokalisering och migration av T-celler i vävnaden analyseras i realtid med en widefield och en konfokalmikroskop. Tekniken som kompletterar in vivo två-photon mikroskopi erbjuder en effektiv metod för att bilden T-celler i sin naturliga miljö och att klarlägga mekanismerna bakom T-cell migration.
Protocol
1. Förbereda skivor från lymfkörtlar
- Förbered en 4% låg smältpunkt agaroslösningen för inbäddning. Späd agaros i PBS och mikrovågsugn denna lösning. När agarosen helt upplöst, underhålla lösningen vid 37 ° C tills redo att användas.
- Förbered en 6-brunnar vävnadskultur. Tillsätt 1,1 ml RPMI komplett odlingsmedium per brunn, och sätt in en organotypic filter i varje brunn. Placera 6-brunnar vid 4 ° C tills att överföra skivor.
- Placera brickor av rostfritt stål, med inre diameter 4 mm, i en plast skål fylld med RPMI komplett medium. Brickor kommer ytterligare att användas för att koncentrera cellerna på vibratome skär skiva.
- Sacrifice musen i enlighet med lokala föreskrifter djurskydd. Ta försiktigt bort perifera lymfkörtlar från den omgivande vävnaden och placera dem i en plast skål med iskallt PBS. Man måste vara försiktig med att inte skada strukturen lymfkörtel, eftersom dessa organ är mycket mjuka.
- Häll 4%-agarosgel i en 35-mm plast skålen och fint överför noderna i gelen. Lämna agarosgel på is i 5 min för att härda.
- Ta bort blocket från skålen och trimma agar för att lämna 3-5 mm gel runt varje lymfkörtel.
- Fäst inbäddade noder på provet disken i vibratome med giftfria vävnad lim. Installera provet skivan i facket fylls med iskall PBS.
- § den agar-inbäddade vävnaden vid 320 ìm tjocklek med vibratome hastigheten inställd på en långsam rad (0,3 mm / s) och vibrationsfrekvens inställt på en medeldistans (1,5 mm).
- Försiktigt överföra skivor lymfkörtel som de skärs upp på organotypic kultur skären med fin pincett. Placera 3 skivor på varje insats. Använd stor försiktighet eftersom skivor kan lätt skadas. En typisk perifer lymfkörtel kommer att ge 5 § Vid ett snitt på 320 ìm. Kasta den första och sista skivor, eftersom de endast innehåller ytliga vävnad.
- Placera rostfria brickor på varje enskild skiva. Se brickor är väl positionerade på agarosen omgivande vävnaden.
- Inkubera kultur plattan vid 37 ° C i en 5% CO 2 fuktas inkubator tills den ska tallrik T-celler.
2. Isolera T-celler från noder mus lymfan
- Isolera T-celler i enlighet med tidigare publicerade JUPITER artikel 3.
- Använd T-celler omedelbart och fortsätt till nästa avsnitt. Annars kan lymfocyter odlas över natten i komplett RPMI-mediet kompletteras med 10 ng / ml IL-7.
3. Märkning av isolerade T-celler
- Tvätta cellerna i HBSS. Resuspendera dem på samma buffert på 10 x 10 6 per ml.
- Tillsätt samma volym HBSS innehåller 1 mikroM Cell Tracker gröna CMFDA ger en slutlig koncentration av 0,5 mikroM.
- Inkubera cellsuspensionen vid 37 ° C under 5 min. Tvätta cellerna två gånger med komplett RPMI-medium.
- Resuspendera cellerna i en slutlig koncentration på 10 x 10 6 per ml i komplett RPMI-medium. Dessa är märkta celler kommer att klädd på skivor.
Andra fluorescerande färger än CMFDA kan användas också, men tänk på att dessa molekyler är potentiellt toxiskt över vissa koncentrationer.
4. Plätering märkta T-celler på skivor lymfkörtel
- Avlägsna överskott av medel i den inre delen av brickan med en pipett. Låt inte vävnaden ska bli torra, arbeta snabbt under detta steg.
- Försiktigt avstå från 10 till 20 l märkta T-celler som motsvarar 1 till 2 x 10 5 celler i den inre delen av brickan. Man måste vara försiktig att inte vidröra vävnaden med spetsen på pipetten. Var noga med att nedgången cellsuspension sitter på plats.
- Lägg skivor med cellerna i inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 i minst 30 min för att lymfocyter att migrera i vävnaden.
5. Imaging T-celler i skivor lymfkörtel
I denna video-artikeln, vi bilden fluorescerande T-celler i skivor lymfkörtel med en widefield inverterat mikroskop och en konfokala upprätt mikroskop.
- Ställ in temperaturen vid 37 ° C. Vår mikroskop är utrustade med temperaturkontrollerad kammare.
- Installera en genomblödning som gör det möjligt kontinuerlig perfusion av lymfkörteln slice med syresatt (5% CO 2, 95% O 2) fenolrött-fri RPMI medium. I vårt system går perfusion medier i bildbehandling kammaren från ena sidan av tyngdkraften. Mediet sugs med en pump kopplad till en insamling av avfall kolv. Ställ in media flödet till 1 ml / min.
- Med fin pincett, försiktigt ta ut bit från 6-brunnar och doppa beredningen i uppvärmda syresatt RPMI medium för ett par sekunder för att bli av fluorescerande celler inte infiltreras i vävnaden.
ImaGing T-celler med ett brett fält inverterat mikroskop
- Placera skiva upp och ner på en skräddarsydd imaging kammare som består av nylon trådar limmas på den inre delen av ett glas botten maträtt. I denna kammare, nylon trådar lyfta bit från glaset och göra det möjligt syresatta lösningen att sprida i vävnaden. Detta är nödvändigt som T cell migration i lymfkörtlar är starkt beroende av syre. Säkra skiva genom att lägga in det en rostfri bricka. Under dessa förhållanden ligger skiva några mikrometer över botten på skålen, vilket underlättar förnyelse av perfusion lösningen.
- För att fånga ett stort synfält (800 x 800 ìm, ungefär en tredjedel av nodens slice yta), samla in bilder med hjälp av en 10x torrt objektiv. Vi fann att 10x Nikon S fluor 0,5 NA var mest lämpade för våra analyser.
Ett typiskt tidsförlopp imaging experiment fångar 5 optisk plan som spänner över ett djup av 50 ìm i axiell (z) dimension. Fluorescerande T-celler är oftast avbildade med intervaller på mellan 10 till 30 sekunder under 10 till 20 min.
Imaging T-celler med en konfokala upprätt mikroskop
Den konfokalmikroskop i detta protokoll är en Leica SP5 utrustad med en 20x nedsänkning i vatten mål (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Säkra segmentet till avbildning skede av mikroskop. Observera: Vi brukar placera en bricka på förberedelserna för att immobilisera den.
- Ställ en avbildning session genom att samla in en serie bilder längs z-axeln. Till celler bilden T i en intakt vävnad struktur, är i startläge vanligtvis 5 till 10 mikrometer under den märkta första T cell.
6. Representativa resultat
Genom att följa denna video-protokollet bör du räkna med att visualisera ett stort antal fluorescerande T-celler ansamlas i T-zonen i nod, ett fenomen som normalt förekommer i denna speciella miljö in vivo (figur 1). I synnerhet bör T-celler uteslutas från B-celler zoner, som oftast precis under kapseln. Ett lyckat experiment kommer också att resultera i T-cellerna rekryteras i vävnaden (figur 2) och visar en mycket rörliga beteende (Figur 3) överensstämmer med publicerade resultat som erhållits i intakt lymfkörtlar 4. I genomsnitt bör medelhastigheten för enskilda T celler i skivor vara nära 10 mikrometer / min (Figur 4).
Figur 1. T-celler ansamlas i en lymfkörtel skiva. Fluorescerande-märkta T-celler (CMFDA, grön) lades till en lymfkörtel skiva 30 min före Image Acquisition (övre bilden). Bilden är den högsta projektion av 5 bilder som spänner över 50 nm i z-riktningen. Det ljusa fältet bilden visas i botten. Bilderna var tagna med en widefield mikroskop.
Figur 2. T-celler rekryteras till en lymfkörtel skiva. Fluorescerande-märkta T-celler (CMFDA, grön) lades till en lymfkörtel skiva 30 min före bildtagning med en konfokalmikroskop. Bilderna var tagna vid snittytan (övre bilden) och 40 ìm nedan (nedre bilden).
Figur 3. T-celler är mycket rörliga i en lymfkörtel skiva. Fluorescerande-märkta T-celler var avbildas under 12 min med en widefield mikroskop. Banor av enskilda T celler visas som färgkodade låtar för att representera större förskjutningar från blått (låg rörliga celler) till rött (hög rörliga celler). Spår har beräknats med hjälp av Imaris programvara. Den vita linjen följer kanten av noden, medan den streckade ovalen avgränsar den förmodade zon B cell.
Figur 4. Inom en lymfkörtel skiva, är T-cell hastighet nära 10 mikrometer / min. Hastigheterna beräknades med hjälp Imaris programvara från spår representerade i figur 3.
Discussion
Vi har beskrivit en enkel, snabb och robust teknik för att generera skivor lymfkörtel, som används för att undersöka beteendet hos introducerade T-celler. På senare år har denna metod använts framgångsrikt använder thymic och lymfa skivor nod för att identifiera den extracellulära faktorer som styr T-cell positionering och motilitet 1,5. Det har också använts för att mäta Ca 2 + svar i tymocyter under positiv selektion och i T-cellerna på antigen erkännande 2,6. Överlägget skiva analysen presenterar fördelar och begränsningar som förtjänar att diskuteras. Notera medger detta system tillgång till vävnaden, användbart om man behöver manipulera skivor farmakologiskt för att störa de molekylära kontrollen av cell migration. Efter bildbehandling kan skivor behandlas för immunohistokemi för att samla in ytterligare information om de strukturer som har avbildat. Dessutom kan observationer göras med en traditionell widefield fluorescensmikroskop. Även om upplösningen inte är lika bra som med en konfokala eller två-photon mikroskop och att fototoxicitet i princip svårare med en-foton än med två-photon mikroskopi, har det fördelarna med enkelhet, en lägre kostnad och större valmöjligheter av excitation våglängder.
Den avbildning av T-celler i ett intakt lymfkörtel kräver intravenös injektion av märkt lymfocyter som sedan hem till lymfoida organ. Som vi har visat tidigare 1, är segmentet analysen helt kompatibel med adoptiv transfer experiment. Däremot kan den tid som behövs för att T-celler till hem till lymfkörtlarna försvåra användningen av fluorescerande färger som har en tendens att läcka ut från cellerna med tiden. Detta är fallet med Ca 2 + dye Fura-2. Med den snabba rekryteringen (<30 min) av T-celler i vävnaden ger slice-analysen en möjlighet att använda sådana färgämnen. Slutligen har denna metod den stora fördelen att analysera T-cell-funktioner i flera mänskliga vävnader hålls levande.
Detta experimentellt system innebär också begränsningar som måste hållas i åtanke. Skador i samband med skivning kan påverka T-cell funktion, särskilt i den ytliga delen av vävnaden nära den skurna ytan. För att bedöma celldöd inom segmentet har vi använt fluorescerande färg SYTOX gröna som tränger celler med nedsatt plasmamembran. Våra experiment visar att ca 20% av det totala nodal celler, främst lokaliserade i den ytliga delen av vävnaden, fluorescerande var märkta med denna kärnkraft färgämne. En annan potentiell oro analysen är möjligheten av skivor för att behålla viktiga lösliga faktorer, kemokiner. Även om vi har inga indikationer på att våra data har påverkats av sådana problem eftersom T-celler visar en bra rörlighet inom segmentet, vill vi betona vikten av avbildning T-celler hos friska regioner som ligger på flera tiotals mikrometer från den skurna ytan. I detta kan göras med traditionella mikroskop (widefield eller konfokala) som i detta protokoll är det troligt att den lymfkörtel slice förberedelser kombinerat med två-photon imaging kommer att öka den rumsliga upplösningen på djupet och minska fototoxicitet.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Alain Trautmann som uppmuntrade oss att utföra skivor lymfkörtel. Detta arbete stöddes delvis med bidrag från Ligue Nationale Contre le Cancer, Fondation pour la Recherche médicale en France och Association pour la recherche sur le Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | Any Supplier | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
References
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. , (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
