Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה פלורסנט התמונה בתאי T הציג לפרוסות הלימפה. הטכניקה אישורים בזמן אמת וניתוחים של נדידת תאים T עם מסורתי widefield פלואורסצנטי או מיקרוסקופים confocal.
Abstract
בתאי T נאיבי ברציפות תנועה הלימפה לאיברים משניים, כולל בלוטות הלימפה ההיקפית, כדי לזהות אנטיגנים הביע נדיר. ההגירה של תאים T לתוך בלוטות הלימפה היא תהליך מורכב אשר כולל שני גורמים הסלולר כימיים כולל chemokines. לאחרונה, השימוש במיקרוסקופ שני הפוטונים אפשרה לעקוב אחר בתאי T בבלוטות הלימפה שלם כדי להפיק כמה מידע כמותי על התנהגותם ויחסי הגומלין שלהם עם תאים אחרים. אמנם יש יתרונות ברורים על מערכת vivo, גישה זו דורשת מכשור מורכב ויקר ומספק גישה מוגבלת לרקמה. כדי לנתח את התנהגותם של תאים T בתוך בלוטות הלימפה Murine, פיתחנו assay פרוסה 1, שהוקם במקורו על ידי neurobiologists ואת משורבב לאחרונה התימוס Murine 2. בטכניקה זו, ותאי T שכותרתו fluorescently הם מצופה על גבי פרוסת מוכן בחריפות הלימפה. במאמר זה וידאו, לוקליזציה והגירה של תאים T לרקמת מנותחים בזמן אמת עם widefield ו מיקרוסקופ confocal. הטכניקה אשר משלים in vivo שני הפוטונים מיקרוסקופיה מציע גישה יעילה לתאי T תמונה בסביבתם הטבעית וכדי להבהיר המנגנונים הגירה T התא.
Protocol
1. הכנת פרוסות של בלוטות הלימפה
- הכינו 4% נמוך ההיתוך פתרון agarose נקודת להטבעת. מדולל agarose בפתרון זה PBS ומיקרוגל. כאשר agarose הוא נמס לגמרי, לשמור על פתרון על 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
- הכן 6-היטב בתרבות צלחת רקמות. הוסף 1.1 מ"ל בינוני RPMI תרבות שלמה לכל היטב, להוסיף מסנן organotypic היטב כל אחד. מניחים את צלחת 6-היטב 4 ° C עד מוכן להעביר את הפרוסות.
- מניחים דיסקיות נירוסטה, עם קוטר פנימי של 4 מ"מ, לתוך צלחת פלסטיק מלאים בינוני RPMI להשלים. Washers ישמש נוספת לרכז את התאים על פרוסת חתך vibratome.
- הקורבן העכבר בהתאם לתקנות רווחת בעלי החיים המקומיים. בזהירות להסיר את בלוטות הלימפה ההיקפית של הרקמה הסובבת ומניחים אותם בצלחת פלסטיק המכיל קר כקרח PBS. יש להקפיד שלא לפגוע במבנה הלימפה, כמו איברים אלה רך מאוד.
- יוצקים את 4%-agarose הג'ל לתוך צלחת בגודל 35 מ"מ פלסטיק בעדינות להעביר את בלוטות לתוך הג'ל. השאירו את הג'ל agarose על קרח דק 5 להתקשות.
- הסר את גוש מהקערה וקוצצים את אגר כדי להשאיר 3-5 מ"מ של ג'ל סביב כל צומת הלימפה.
- צרף את בלוטות מוטבע בדיסק הדגימה של vibratome עם דבק רעיל רקמות. התקן את הדיסק הדגימה במגש מלא קר כקרח PBS.
- סעיף אגר, מוטבע על עובי רקמת 320 מיקרומטר במהירות vibratome להגדיר על מגוון איטי (0.3 מ"מ / s) ואת תדירות רטט להגדיר על מגוון בינוני (1.5 מ"מ).
- להעביר בזהירות פרוסות הצומת לימפה כפי שהם נחתכות על מחדיר תרבות organotypic באמצעות מלקחיים בסדר. מניחים 3 פרוסות על כל הכנס. השתמש בזהירות רבה כמו פרוסות עלולים להיפגע בקלות. הצומת לימפה טיפוסי היקפי תניב 5 חלקים כאשר לחתוך ב 320 מיקרומטר. מחק את פרוסות הראשונה והאחרונה, כפי שהם מכילים רק רקמות שטחיות.
- מניחים דיסקיות נירוסטה על כל פרוסה בודדים. ודא מנקי ממוקמים היטב על agarose סביב רקמות.
- דגירה את הצלחת התרבות ב 37 מעלות של 5% CO 2 באינקובטור humidified עד מוכן בתאי T צלחת.
2. בידוד בתאי T של בלוטות הלימפה העכבר
- לבודד תאים T על פי המאמר שפורסם בעבר יופיטר 3.
- השימוש בתאי T מיד להמשיך לסעיף הבא. אחרת, לימפוציטים יכול להיות מתורבת לילה שלם RPMI בינוני בתוספת 10 ng / ml IL-7.
3. תיוג של תאים T מבודד
- שטפו תאים HBSS. Resuspend אותם למאגר באותו בגודל 10 x 10 6 לכל מ"ל.
- מוסיפים את נפח זהה של HBSS המכיל 1 מיקרומטר Cell Tracker ירוק CMFDA נותן ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר.
- לדגור על השעיית התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. שטפו פעמיים עם תאים להשלים RPMI בינוני.
- תאים Resuspend בריכוז סופי של 10 x 10 6 לכל מ"ל להשלים RPMI בינוני. תאים אלה שכותרתו תהיה מצופה על הפרוסות.
צבעי ניאון מלבד CMFDA עשוי לשמש מדי, אבל יש לזכור כי מולקולות אלה הם רעילים בריכוזים מעל מסוימים.
4. שכותרתו ציפוי בתאי T על גבי פרוסות הלימפה
- הסר בינוני עודף הכלול בחלק הפנימי של מכונת הכביסה עם טפטפת. אל תאפשר הרקמה להיות יבש; לעבוד במהירות במהלך שלב זה.
- בעדינות לוותר על 10-20 שכותרתו μl T תאים התואם 1-2 x 10 5 תאים בחלק הפנימי של מכונת הכביסה. יש להקפיד לא לגעת עם רקמת קצה פיפטה. הקפד כי ירידה של השעיה התא נשאר במקום.
- מניחים את פרוסות עם תאים החממה ב 37 ° C ו 5% CO 2 דקות לפחות 30 כדי לאפשר לימפוציטים להגר לתוך הרקמה.
5. הדמיה T תאים בתוך פרוסות הלימפה
במאמר-video זה, אנו פלורסנט התמונה T לתאים הצומת לימפה פרוסות עם מיקרוסקופ widefield הפוכה מיקרוסקופ confocal זקוף.
- הגדר את הטמפרטורה 37 ° C. מיקרוסקופים שלנו מצוידים בתאי בקרת טמפרטורה.
- התקנת מערכת המאפשרת זלוף זלוף רציפה של הפרוסה לימפה הצומת עם מחומצן בינוני (5% CO 2, 95% O 2) RPMI פנול אדום חופשי. במערכת שלנו, התקשורת perfused נכנס לתוך תא הדמיה מצד אחד על ידי כוח הכבידה. המדיום הוא aspirated עם משאבה מחוברת בבקבוק איסוף פסולת. הגדר את קצב זרימת מדיה 1 מ"ל / דקה.
- בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות להוציא את נתח מהצלחת 6-הבאר לטבול הכנת במדיום חימם RPMI מחומצן במשך כמה שניות כדי להיפטר תאים פלורסנט לא הסתננו לתוך הרקמה.
אמאגינג בתאי T עם מיקרוסקופ שדה רחב הפוכה
- מניחים את נתח במהופך על תא מחוייט הדמיה אשר מורכב של חוטי ניילון מודבק על החלק הפנימי של צלחת תחתית הכוס. בחדר זה, חוטי ניילון להעלות את נתח מן הכוס ולאפשר פתרון מחומצן לנטרל לתוך הרקמה. זה נדרש כמו הגירה T תא בבלוטות הלימפה תלויה מאוד חמצן. Secure את הפרוסה על ידי הוספת על זה מכונת כביסה נירוסטה. בתנאים אלה, פרוסה טמון מיקרונים אחדים מעל החלק התחתון של המנה, המאפשר חידוש הפתרון זלוף.
- כדי ללכוד שדה גדול של השקפה (800 x 800 מיקרומטר, כשליש משטח פרוסה של מפרק), לאסוף תמונות באמצעות עדשה 10x אובייקטיבי ויבש. מצאנו כי 10x Nikon S פלואוריד 0.5 NA היה המתאים ביותר עבור מנתח שלנו.
ניסוי טיפוסי זמן לשגות הדמיה לוכדת 5 מטוסים אופטי פורש עומק סך של 50 מיקרומטר בממד צירית (z). פלורסנט ותאי T הם צילמו בדרך כלל במרווחי זמן הנעים בין 10 עד 30 שניות במשך 10 דקות עד 20.
דימות באמצעות מיקרוסקופ בתאי T זקוף confocal
מיקרוסקופ confocal להשתמש בפרוטוקול זה Leica SP5 מצויד מטרה 20x טבילה במים (אולימפוס, 20x/0.95 NA).
- Secure הפרוסה לשלב הדמיה של המיקרוסקופ. הערה: בדרך כלל אנחנו במקום מכונת הכביסה על הכנת כדי לשתק אותו.
- קבע פגישה הדמיה על ידי איסוף סדרה של תמונות לאורך ציר z. כדי בתאי T תמונה במבנה רקמות שלמות, עמדת להתחיל מוגדר בדרך כלל בשעה 5 עד 10 מיקרומטר מתחת תא T הראשון שכותרתו.
6. נציג תוצאות
על ידי ביצוע זו וידאו פרוטוקול עליך לצפות לדמיין מספר גדול של תאים T ניאון שהצטברו באזור ה-T של הצומת, תופעה שבדרך כלל מתרחשת בסביבה מסוימת זו in vivo (איור 1). בפרט, ותאי T צריך להיות מחוץ לאזורי תא B, אשר בדרך כלל רק מתחת הקפסולה. ניסוי מוצלח יהיה גם לגרום לתאי T גייס לתוך הרקמה (איור 2), הצגת התנהגות ניעתי מאוד (איור 3) עולה בקנה אחד עם התוצאות שפורסמו שהושגו בלוטות הלימפה שלם 4. בממוצע, מהירות ממוצעת של T תאים בודדים בתוך פרוסות צריך להיות קרוב ל 10 מיקרומטר / דקה (איור 4).
באיור 1. בתאי T להצטבר פרוסת הלימפה. Fluorescently שכותרתו ותאי T (CMFDA, ירוק) נוספו 30 דקות הלימפה פרוסה לפני רכישת התמונה (תמונה למעלה). התמונה היא השלכה המרבי של 5 תמונות פורש 50 מיקרומטר בכיוון z. התמונה בשדה בהיר מוצג למטה. תמונות שנתפסו עם מיקרוסקופ widefield.
איור 2. בתאי T מגויסים לתוך פרוסת הלימפה. Fluorescently שכותרתו ותאי T (CMFDA, ירוק) נוספו 30 דקות הלימפה פרוסה לפני רכישת התמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal. תמונות שנתפסו על פני השטח חתך (בתמונה למעלה) ו 40 מיקרומטר למטה (תמונה למטה).
איור 3. ותאי T הם מאוד ניעתי בתוך פרוסת הלימפה. בתאי T fluorescently שכותרתו היו צילמו במשך 12 דקות באמצעות מיקרוסקופ widefield. מסלולים של הפרט בתאי T מוצגים בקידוד צבע מסלולים לייצג התקות גוברת מצד כחול (תאים ניעתי נמוך) לאדום (תאים ניעתי גבוהה). שירים חושבו באמצעות התוכנה Imaris. הקו הלבן עוקב אחר קצה של הצומת, ואילו הסגלגל מקווקו התוחם את אזור המשוערת תא B.
איור 4. בתוך פרוסת הלימפה, מהירות תא T קרובה 10 מיקרומטר / min. מהירויות חושבו באמצעות תוכנת Imaris מהמסילה מיוצג באיור 3.
Discussion
תיארנו טכניקה פשוטה, מהירה וחזקה להפקת הלימפה פרוסות, המשמשים כדי לחקור את התנהגותם של תאים T הציג. בשנים האחרונות, שיטה זו יושמה בהצלחה באמצעות הרתי ואת הצומת פרוסות הלימפה כדי לזהות את הגורמים תאיים השליטה מיצוב תא T ו תנועתיות 1,5. הוכח גם למדידת Ca 2 + תגובות thymocytes במהלך בחירת חיוביים בתאי T על ההכרה אנטיגן 2,6. Assay פרוסה כיסוי מציגה יתרונות ומגבלות שראוי לדון בו. ראוי לציין, מערכת זו מאפשר גישה לרקמה, שימושי אם צריך לתמרן פרוסות פרמקולוגית כדי להפריע לשליטה המולקולרי של נדידת תאים. לאחר הדמיה, הפרוסות יכול להיות מעובד על אימונוהיסטוכימיה לאסוף מידע נוסף על מבנים שכבר צילמו. יתר על כן, תצפית יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי widefield המסורתית. למרות ההחלטה הוא לא טוב כמו עם confocal או מיקרוסקופ שני הפוטונים ו phototoxicity כי הוא עקרונית חמורה יותר עם פוטון אחד מאשר עם מיקרוסקופ שני הפוטונים, יש לו את היתרונות של פשטות, עלות נמוכה יותר, ובחירה גדולה יותר של אורכי גל עירור.
הדמיה של תאים T בתוך הצומת לימפה שלם דורש הזרקה תוך ורידית של לימפוציטים שכותרתו כי בית לאחר מכן הלימפה לאיברים. כפי שהראינו לעיל 1, assay פרוסה תואם לחלוטין עם בניסוי העברת המאמצת. עם זאת, משך הזמן הדרוש בתאי T לבית אל בלוטות הלימפה יכול לסבך את השימוש של צבעי ניאון, כי יש נטייה לדלוף של התאים לאורך זמן. זהו המקרה של Ca 2 + צבע fura-2. עם גיוס מהיר (<30 דקות) של תאים T לתוך הרקמה, assay פרוסה מספקת הזדמנות להשתמש בצבעים כאלה. לבסוף, בשיטה זו יש יתרון גדול לנתח פונקציות תא T ברקמות אנושיות מספר לשמר אותם.
מערכת זו מציגה את הניסוי גם מגבלות שצריך לזכור. נזק הקשורים חיתוך עשוי להשפיע על תפקוד תא T, במיוחד באזור שטחית של הרקמה קרוב לפני השטח לחתוך. על מנת להעריך מוות של תאים בתוך הפרוסה, השתמשנו צבע ירוק ניאון SYTOX החודרת תאים עם הממברנה הפלסמטית בסכנה. הניסויים שלנו מראים כי כ -20% מכלל התאים קטרי, מקומי בעיקר באזור שטחית של הרקמה, היו שכותרתו fluorescently עם צבע זה גרעיני. דאגה נוספת עם פוטנציאל assay הוא היכולת של הפרוסות כדי לשמור על גורמים מסיסים החשובים כולל chemokines. אמנם, אין לנו שום אינדיקציה כי הנתונים שלנו הושפעו בעיות כאלה מאז בתאי T להציג תנועתיות טובה בתוך הפרוסה, ברצוננו להדגיש את החשיבות של תאים הדמיה T באזורים בריא הממוקם כמה עשרות מיקרונים מפני השטח לחתוך. לעומת זאת, ניתן לעשות זאת עם מיקרוסקופים המסורתית (widefield או confocal) כמו בפרוטוקול זה, סביר להניח כי הלימפה הכנה פרוסה בשילוב עם שני הפוטונים הדמיה יגדיל את ברזולוציה מרחבית לעומק ולהקטין את phototoxicity.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות ד"ר אלן Trautmann שעודד אותנו לבצע הצומת פרוסות הלימפה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של הלאומית Ligue Contre Le הסרטן, מגט לשפוך en la משוכלל ונדיר Médicale צרפת לשפוך האגודה למלחמה בסרטן la משוכלל ונדיר sur le.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | Any Supplier | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
References
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. , (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
