Summary
このプロトコルは、リンパ節のスライスに導入された画像蛍光T細胞への方法を説明します。技術は、従来の広視野蛍光または共焦点顕微鏡でのT細胞遊走のリアルタイム分析を可能にします。
Abstract
まれに発現する抗原を検出するために末梢リンパ節、を含む、二次リンパ器官へのナイーブT細胞が継続的にトラフィック。リンパ節にT細胞の遊走はケモカインを含む細胞と化学の両方の要素を含む複雑なプロセスです。最近、二光子顕微鏡の使用は、無傷のリンパ節にT細胞を追跡するために、他の細胞と彼らの行動とその相互作用にいくつかの定量的な情報を得るために許可しています。 in vivo系への明らかな利点がありますが、このアプローチは、複雑で高価な計測機器を必要とし、組織への制限されたアクセスを提供します。マウスリンパ節内T細胞の挙動を分析するために、我々は、スライスのアッセイ1、もともとneurobiologistsが立ち上げてマウス胸腺2に、最近転置を開発しました。この手法では、蛍光標識T細胞は、急性準備リンパ節のスライスの上にメッキされています。このビデオの記事では、組織へのT細胞の局在と移行は、広視野と共焦点顕微鏡でリアルタイムに分析されます。 in vivoで二光子顕微鏡は、自然環境の中で画像のT細胞への効果的なアプローチを提供し、T細胞の移動のメカニズムを解明するために補完する技術。
Protocol
1。リンパ節からのスライスの準備
- 埋め込みには4％低融点アガロース溶液を調製。 PBSおよびマイクロ波このソリューションでアガロースを希釈する。アガロースが完全に溶解したら、° C準備が整うまでの使用のために37のソリューションを維持する。
- 6ウェル組織培養プレートを準備します。ウェルあたり1.1ミリリットルRPMI完全培地を追加し、各ウェルにおける器官型フィルタを挿入する。 4℃で6 - ウェルプレートを置き、スライスを転送する準備までのC。
- RPMI完全培地で満たされたプラスチック製の皿に、4 mmの内径で、ステンレス製のワッシャーを置きます。ワッシャーはさらにビブラトームカットのスライス上に細胞を濃縮するために使用されます。
- 地元の動物福祉の規則に従って、マウスを犠牲にする。慎重に周囲の組織から末梢リンパ節を切除すると、氷冷したPBSを含むプラスチック製の皿に置いてください。これらの器官は非常にソフトなので注意は、リンパ節の構造に損傷を与えないように注意する必要があります。
- 35mmプラスチックシャーレに4％アガロースゲルを注ぐと繊細なゲルにノードを移す。硬化まで5分間氷上でアガロースゲルを残す。
- 皿からブロックを削除し、各リンパ節の周囲にゲルの3〜5 mmを残すために寒天をトリミング。
- 無毒の組織接着剤でビブラトームの試料のディスク上に埋め込まれたノードを取り付けます。氷冷PBSで満たされたトレイに試料ディスクを取り付けます。
- セクション遅い範囲（0.3 mm / sの）と中距離（1.5 mm）に設定された振動の周波数に設定さビブラトーム速度320μmの厚さで寒天包埋組織。
- それらは微細な鉗子を用いて器官培養用インサートの上にカットされているように慎重にリンパ節のスライスを転送する。各インサートの3スライスを置きます。スライスが簡単に破損することができるように細心の注意を使用してください。 320μmでカットするときに典型的な末梢リンパ節は、5つのセクションが得られます。彼らは表面的な組織を含んでいるので、最初と最後のスライスを捨てる。
- 個々のスライスにステンレス製のワッシャーを置きます。ワッシャーはよく組織を取り巻くアガロース上に配置されていることを確認します。
- 37℃で培養プレートをインキュベート℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中でCプレートT細胞への準備ができるまで。
2。マウスのリンパ節からT細胞を単離する
- 以前に発行されたJoveの第3条によれば、T細胞を分離する。
- すぐにT細胞を使用して、次のセクションに進んでください。そうでなければ、リンパ球は10 ng / mlのIL - 7を添加したRPMI -培地を完全に一晩培養される可能性があります。
3。分離されたT細胞のラベリング
- HBSSで細胞を洗浄。 ml当たり10 × 10 6で同じバッファーで再懸濁します。
- 0.5μMの最終濃度を与える1μMセルトラッカーグリーンCMFDAを含むHBSSの同じボリュームを追加します。
- ℃で5分間の間に37℃で細胞懸濁液をインキュベートする。 RPMI -培地を完全に細胞を2回洗浄する。
- RPMI -培地を完全にmlあたり10 × 10 6の最終濃度で再懸濁し、細胞。これらの標識された細胞は、スライス上にプレーティングされます。
CMFDA以外の蛍光色素は余りに使用されますが、これらの分子は一定の濃度を上記の潜在的に有毒であることに留意してください可能性がある。
4。メッキは、リンパ節のスライスの上にT細胞を標識し
- ピペットとワッシャーの内側の一部に含まれる余分な培地を削除します。組織が乾燥しないようにしてください。このステップですぐに働く。
- ゆっくりとワッシャの内側の部分に1〜2 × 10 5細胞に相当する10〜20μlのラベルされたT細胞を分注する。ケアは、ピペットの先端で組織に触れないように注意する必要があります。細胞懸濁液の滴が所定の位置に留まることを確認してください。
- 37℃インキュベーターで細胞とスライスを配置℃、5％リンパ球が組織に移行できるように、少なくとも30分間CO 2。
5。リンパ節のスライス内イメージングT細胞
このビデオの記事で、我々広視野倒立顕微鏡と共焦点正立顕微鏡でリンパ節スライスの画像蛍光T細胞。
- 37℃の温度を℃に設定私たちの顕微鏡は、温度制御されたチャンバーを備えています。
- 酸素（5％CO 2、95％O 2）フェノールレッドを含まないRPMI培地でリンパ節のスライスの連続的な灌流を可能にする灌流システムをインストールします。私たちのシステムでは、潅流媒体は重力によって片側から撮影室に入ります。培地は、廃棄物の収集フラスコに接続されたポンプで吸引される。メディアの流速1ml /分に設定します。
- 細かい鉗子で、微妙に6 - ウェルプレートからスライスを取り出し、組織に浸透しない蛍光細胞を取り除くために数秒間温め、酸素RPMI培地中で準備をディップ。
IMA広視野倒立顕微鏡でT細胞パトンの
- ガラスボトムディッシュの内側の一部に接着されたナイロン糸で構成されてカスタムメイドのイメージングチャンバーに逆さにスライスを置きます。このチャンバーでは、ナイロン糸、ガラスからスライスを昇格し、組織に拡散する酸素ソリューションを有効にします。リンパ節におけるT細胞の遊走は、酸素に強く依存するとして、これは必須です。その上にステンレス製のワッシャーを追加してスライスを固定します。これらの条件では、スライスには、灌流液の更新を容易に皿の底部上に数ミクロンの場所にあります。
- 広い視野（800 × 800μmの、ノードのスライス面の約3分の1）をキャプチャするには、10倍、乾燥対物レンズを使用して画像を収集する。我々は10倍ニコンSフッ素0.5 NAは我々の分析に最も適していたことがわかった。
典型的なタイムラプスイメージングの実験は、軸方向（z）の寸法が50μmの合計深さにまたがる5オプティカル平面をキャプチャします。蛍光T細胞は、通常10〜20分中10〜30秒までの間隔で撮像される。
共焦点正立顕微鏡とイメージングT細胞
このプロトコルで使用されている共焦点顕微鏡は20倍の水浸対物レンズ（オリンパス、20x/0.95 NA）を搭載したライカSP5です。
- 顕微鏡のイメージング段階にスライスを確保する。注：私達は通常それを固定するために準備にワッシャーを配置。
- z軸に沿って一連の画像を収集することにより、イメージングセッションを設定します。無傷の組織構造内の画像のT細胞に、開始位置は、通常、最初のラベルの付いたT細胞より5〜10μm程度に設定されています。
6。代表的な結果
このビデオプロトコルに従うことで、ノードのTゾーン、通常は生体内でこの特定の環境（図1）で起こる現象に蓄積された蛍光性T細胞の多数を可視化することを期待してください。特に、T細胞は、ちょうどカプセルの下に通常あるB細胞のゾーン、から除外する必要があります。成功した実験はまた、無傷のリンパ節4で得られた公表された結果と整合性の高い運動性の行動（図3）を表示し、組織（図2）に勧誘T細胞になります。平均では、スライス内の個々のT細胞の平均速度は近い〜10μm/分（図4）でなければなりません。
図1。 T細胞はリンパ節のスライスに蓄積する。蛍光標識T細胞（CMFDA、緑）画像取得の前にリンパ節のスライス30分（上写真）に追加された。画像は、z方向に50μmをまたがる5枚の画像の最大投影です。明視野像は、底部に示されています。画像は広視野顕微鏡で取得されたものです。
図2。 T細胞はリンパ節のスライスに採用されています。蛍光標識T細胞（CMFDA、緑）共焦点顕微鏡を用いて画像取得の前にリンパ節のスライス30分に追加された。画像は切断面（上写真）と、以下の40μmの（下の写真）で捕獲された。
図3。 T細胞はリンパ節のスライス内で非常に運動性があります。蛍光標識T細胞は広視野顕微鏡を使用して12分間で画像化した。個々のT細胞の軌跡は、（高運動性細胞）赤青（低運動性の細胞）から増加する変位を表現するために色分けされたトラックとして表示されます。トラックはImarisソフトウェアを用いて計算した。破線の楕円は、推定されるB細胞のゾーンを区切るのに対し、白い線は、ノードのエッジに従います。
図4。リンパ節のスライス内では、T細胞の速度は10μm/分の近くにあります。速度を図3に表されたトラックからImarisソフトウェアを用いて計算した。
Discussion
我々は、導入T細胞の挙動を調査するために使用されるリンパ節のスライスを、生成するための簡単な、迅速かつ堅牢なテクニックを説明してきました。近年では、このメソッドは、T細胞の位置と運動性1,5を制御する細胞外因子を同定するために胸腺およびリンパ節のスライスを使用して正常に適用されています。また、正の選択時および抗原認識2,6時にT細胞の胸腺細胞でのCa 2 +応答を測定するために使用されています。オーバーレイのスライスのアッセイは、議論されるに値する利点と制限があります。必要なものはは、細胞遊走の分子制御を妨害するために、薬理学的にスライスを操作する場合注目すべきは、このシステムでは有用な、組織へのアクセスを許可します。画像に続いて、スライスが撮像されている構造についてのさらなる情報を収集するために、免疫組織化学のために処理することができます。また、観察は、従来の広視野の蛍光顕微鏡で行うことができます。解像度は、共焦点または二光子顕微鏡とほど良好ではないとその光毒性は原則的に二光子顕微鏡による複数の光子とのより深刻な場合、それは単純さ、低コスト、そしてより大きな選択の利点がありますが、励起波長の。
無傷のリンパ節におけるT細胞のイメージングは、そのリンパ器官に続いてホームラベル付けリンパ球の静脈注射を必要とします。我々は以前に1を示しているように、スライスのアッセイは、養子移入実験と完全に互換性があります。しかし、リンパ節へホームへのT細胞に必要な時間の長さは、時間の経過とともに細胞外に漏出する傾向を持っている蛍光染料の使用を複雑にすることができます。これは、Ca 2 +染料フラ-2のケースです。組織へのT細胞の迅速な採用（<30分）で、スライスのアッセイは、このような染料を使用する機会を提供します。最後に、この方法はいくつかのヒト組織でのT細胞機能を解析することには大きな利点が生きて維持している。
この実験系では、留意する必要があるにも制限があります。スライスに関連付けられている被害は、特に切断面付近の組織の表面的な領域で、T細胞の機能に影響を与える可能性があります。スライス内の細胞死を評価するために、我々は、標的の原形質膜と細胞を貫通する蛍光染料SYTOXの緑を使用している。我々の実験は、主に組織の表層領域に局在総リンパ節細胞、、の約20％が蛍光この核の色素で標識されたことが明らかになった。アッセイのもう一つの潜在的な懸念は、ケモカインなどの重要な可溶性因子を保持するスライスの能力です。 、我々はT細胞がスライス内で良好な運動性を表示するので、私たちのデータは、このような問題の影響を受けている兆候がないが、我々は、切断面から数十μmにある健康な地域でのイメージングT細胞の重要性を強調したい。これはこのプロトコルのような伝統的な顕微鏡（広視野または共焦点）で行うことができるのに対し、それはリンパ節のスライス標本は、2光子イメージングは深さで空間分解能を向上させ、光毒性を低減すると結合される可能性があります。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
著者は、私たちはリンパ節のスライスを実行するよう奨励博士アラントラウトマンに感謝したいと思います。この作品は、リーグ国立Contreルがん、財団原子核Médicaleのフランスと連合原子核シュルルのがんからの補助金によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | Any Supplier | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
References
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
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- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
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- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
