Summary
इस प्रोटोकॉल छवि फ्लोरोसेंट टी कोशिकाओं लसीका नोड स्लाइस में शुरू करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. तकनीक पारंपरिक widefield प्रतिदीप्ति या confocal सूक्ष्मदर्शी के साथ टी सेल प्रवास की वास्तविक समय विश्लेषण परमिट.
Abstract
भोले टी कोशिकाओं को लगातार परिधीय लिम्फ नोड्स, दुर्लभ व्यक्त एंटीजन का पता लगाने सहित माध्यमिक lymphoid अंगों, यातायात. लिम्फ नोड्स में टी कोशिकाओं के प्रवास एक जटिल प्रक्रिया है जो दोनों सेलुलर और रासायनिक कारकों chemokines सहित शामिल है. हाल ही में, दो photon माइक्रोस्कोपी के उपयोग बरकरार लिम्फ नोड्स में टी कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए और अन्य कक्षों के साथ उनके व्यवहार और उनकी बातचीत पर कुछ मात्रात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए अनुमति दी है. जबकि वहाँ vivo प्रणाली में एक स्पष्ट लाभ कर रहे हैं, इस दृष्टिकोण एक जटिल और महंगी इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता है और ऊतकों को सीमित पहुँच प्रदान करता है है . Murine लिम्फ नोड्स के भीतर टी कोशिकाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए, हम एक टुकड़ा 1 परख, मूल neurobiologists द्वारा स्थापित और murine thymus 2 के लिए हाल ही में transposed विकसित किया है. इस तकनीक में, fluorescently लेबल टी कोशिकाओं एक तीव्रता से तैयार लसीका नोड टुकड़ा के शीर्ष पर चढ़ाया जाता है. इस वीडियो लेख में, स्थानीयकरण और ऊतकों में टी कोशिकाओं के प्रवास एक widefield और एक confocal खुर्दबीन के साथ वास्तविक समय में विश्लेषण कर रहे हैं. तकनीक है जो vivo में दो photon माइक्रोस्कोपी छवि टी कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक वातावरण में एक प्रभावी दृष्टिकोण प्रदान करता है और टी सेल प्रवास अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट पूरक.
Protocol
1. लिम्फ नोड्स से तैयारी स्लाइस
- Embedding के लिए एक 4% कम पिघलने बिंदु agarose समाधान तैयार करें. पीबीएस और माइक्रोवेव इस समाधान में agarose पतला. जब agarose पूरी तरह भंग है, 37 डिग्री सेल्सियस जब तक तैयार उपयोग के लिए समाधान बनाए रखने.
- 6 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति की थाली तैयार है. 1.1 अच्छी तरह से प्रति मिलीलीटर RPMI पूरा मध्यम संस्कृति जोड़ें, और प्रत्येक कुएं में एक organotypic फ़िल्टर डालने. 4 में 6 अच्छी तरह से थाली प्लेस डिग्री सेल्सियस तक स्लाइस हस्तांतरण के लिए तैयार है.
- स्टेनलेस स्टील वाशर प्लेस, RPMI पूरा मध्यम के साथ भरा एक प्लास्टिक डिश में 4 मिमी के भीतरी व्यास के साथ. वाशर आगे vibratome कटौती टुकड़ा पर कोशिकाओं ध्यान केंद्रित किया जाएगा.
- स्थानीय पशु कल्याण के नियमों के अनुसार माउस बलिदान. ध्यान से आसपास के ऊतकों से परिधीय लिम्फ नोड्स हटाने और उन्हें एक प्लास्टिक पकवान युक्त बर्फ के ठंडे पीबीएस में जगह. देखभाल करने के लिए लसीका नोड संरचना को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए, के रूप में इन अंगों को बहुत नरम हैं.
- 35 मिमी एक प्लास्टिक पकवान में 4% agarose जेल डालो और नाजुक जेल में नोड्स हस्तांतरण. 5 मिनट के लिए कठोर बर्फ पर agarose जेल छोड़ो.
- ब्लॉक को पकवान से निकालें और अगर ट्रिम क्रम में प्रत्येक लसीका नोड जेल के 3-5 मिमी के आसपास छोड़.
- गैर विषैले ऊतक गोंद के साथ vibratome का नमूना डिस्क पर एम्बेडेड नोड्स लगायें. पीबीएस बर्फ की ठंड से भरा ट्रे में नमूना डिस्क स्थापित.
- धारा अगर एम्बेडेड vibratome एक धीमी गति सीमा पर निर्धारित गति (0.3 मिमी / एस) और कंपन आवृत्ति एक मध्यम दूरी (1.5 मिमी) पर सेट के साथ 320 सुक्ष्ममापी मोटाई में ऊतक.
- ध्यान लसीका नोड स्लाइस हस्तांतरण के रूप में वे organotypic संस्कृति ठीक संदंश का उपयोग आवेषण पर किया जा रहा है काट रहे हैं. प्रत्येक डालने पर 3 स्लाइस रखें. महान देखभाल के रूप में स्लाइस आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है का उपयोग करें. एक ठेठ परिधीय लसीका नोड 5 वर्गों को उपज जब 320 सुक्ष्ममापी में कटौती करेगा. पहली और आखिरी स्लाइस त्यागें, के रूप में वे केवल सतही ऊतक होते हैं.
- प्रत्येक व्यक्ति टुकड़ा पर स्टेनलेस स्टील वाशर रखें. सुनिश्चित करें वाशर को अच्छी तरह से ऊतक आसपास agarose पर तैनात हैं.
- 37 में संस्कृति की थाली सेते ° सी में एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर तक थाली टी कोशिकाओं के लिए तैयार है .
2. माउस लिम्फ नोड्स से टी कोशिकाओं को अलग
- पहले प्रकाशित जौव 3 लेख के अनुसार टी कोशिकाओं को अलग.
- टी कोशिकाओं को तुरंत का प्रयोग करें और अगले अनुभाग पर जाएँ. अन्यथा, लिम्फोसाइटों RPMI मध्यम पूरा 10 एनजी / एमएल आईएल-7 के साथ पूरक में रात भर सुसंस्कृत हो सकता है.
3. पृथक टी कोशिकाओं के लेबल
- HBSS में कोशिकाओं धो लें. उन्हें 10 x 10 मिलीलीटर प्रति 6 में एक ही बफर में Resuspend.
- 1 सुक्ष्ममापी सेल ट्रैकर हरी CMFDA 0.5 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता देने वाले HBSS की ही मात्रा में जोड़ें.
- 37 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के दौरान सेल निलंबन सेते हैं. पूरा RPMI मध्यम के साथ कोशिकाओं में दो बार धो.
- 10 x 10 मिलीलीटर प्रति पूरा RPMI मध्यम में 6 की एक अंतिम एकाग्रता में Resuspend कोशिकाओं. ये लेबल कोशिकाओं स्लाइस पर चढ़ाया जाएगा.
CMFDA अन्य की तुलना में फ्लोरोसेंट रंजक भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन ध्यान में रखना है कि इन अणुओं निश्चित सांद्रता के ऊपर संभावित विषाक्त कर रहे हैं.
4. चढ़ाना लसीका नोड स्लाइस पर लेबल टी कोशिकाओं
- अतिरिक्त एक विंदुक के साथ वॉशर के भीतरी भाग में निहित मध्यम निकालें. अनुमति नहीं ऊतक सूखी बनने के लिए, इस कदम के दौरान जल्दी से काम करते हैं.
- धीरे 10 से 20 μl लेबल टी कोशिकाओं है कि 1 से 2 x 10 5 वॉशर के भीतरी भाग में कोशिकाओं से मेल खाती है है बग़ैर . केयर पिपेट की नोक के साथ ऊतक छू नहीं लिया जाना चाहिए. यह सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन के ड्रॉप जगह में रहता है.
- इनक्यूबेटर में कोशिकाओं के साथ 37 स्लाइस प्लेस डिग्री सेल्सियस और 5% कम से कम 30 मिनट के लिए सीओ 2 लिम्फोसाइटों ऊतकों में विस्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं.
5. इमेजिंग टी कोशिकाओं लसीका नोड स्लाइस के भीतर
इस वीडियो लेख में, हम एक widefield उलटा माइक्रोस्कोप और एक confocal खुर्दबीन ईमानदार के साथ लसीका नोड स्लाइस में छवि फ्लोरोसेंट टी कोशिकाओं.
- 37 में तापमान सेट डिग्री सेल्सियस हमारे सूक्ष्मदर्शी तापमान नियंत्रित कक्षों के साथ सुसज्जित हैं.
- एक छिड़काव oxygenated (5% 2 सीओ, 95% 2 हे) फिनोल लाल मुक्त RPMI मध्यम के साथ लसीका नोड टुकड़ा के निरंतर छिड़काव सक्षम प्रणाली स्थापित करें . हमारी प्रणाली में, गंभीरता से एक तरफ से perfused मीडिया इमेजिंग कक्ष में प्रवेश करती है है. मध्यम बर्बादी संग्रह कुप्पी से जुड़े पंप के साथ से aspirated है. मीडिया प्रवाह दर 1 मिलीग्राम / मिनट के लिए सेट.
- ठीक संदंश के साथ, नाजुक 6 अच्छी तरह से थाली से बाहर टुकड़ा ले और गर्म oxygenated फ्लोरोसेंट ऊतक में घुसपैठ नहीं कोशिकाओं से छुटकारा पाने के लिए कुछ सेकंड के लिए RPMI मध्यम तैयारी में डुबकी.
भारतीय सैन्य अकादमीएक व्यापक क्षेत्र उलटा माइक्रोस्कोप के साथ टी कोशिकाओं ging
- एक कस्टम निर्मित इमेजिंग चैम्बर जो नायलॉन के धागे का एक गिलास नीचे डिश के भीतरी भाग पर चिपके होते हैं पर उल्टा टुकड़ा रखें. इस कक्ष में, नायलॉन के धागे ग्लास से टुकड़ा तरक्की और oxygenated ऊतक में फैलाना समाधान को सक्षम. यह है के रूप में टी सेल प्रवास लिम्फ नोड्स में जोरदार ऑक्सीजन पर निर्भर है की आवश्यकता है. पर यह एक स्टेनलेस स्टील वॉशर जोड़कर टुकड़ा सुरक्षित. इन परिस्थितियों में, टुकड़ा पकवान, जो छिड़काव समाधान के नवीकरण की सुविधा के नीचे से ऊपर एक microns कुछ निहित है.
- देखने के एक बड़े क्षेत्र (800 x 800 सुक्ष्ममापी, नोड का टुकड़ा सतह के लगभग एक तिहाई) पर कब्जा करने के लिए, एक 10x सूखी उद्देश्य लेंस का उपयोग कर छवियों को इकट्ठा. हमने पाया है कि 10x Nikon एस fluor 0.5 एनए हमारे विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त था.
एक ठेठ इमेजिंग समय चूक प्रयोग 5 ऑप्टिकल axial आयाम (z) में 50 सुक्ष्ममापी की कुल गहराई फैले विमानों कब्जा. प्रतिदीप्त टी कोशिकाओं आमतौर पर 10 से 20 मिनट के दौरान 10 से 30 सेकंड से लेकर अंतराल पर imaged हैं.
इमेजिंग एक confocal ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ टी कोशिकाओं
इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता confocal खुर्दबीन एक Leica SP5 एक 20x पानी विसर्जन उद्देश्य (ओलिंप, 20x/0.95 एनए) के साथ सुसज्जित है.
- माइक्रोस्कोप के इमेजिंग मंच टुकड़ा सुरक्षित. नोट: हम आम तौर पर यह स्थिर तैयारी पर एक वॉशर जगह.
- Z अक्ष के साथ छवियों की एक श्रृंखला को इकट्ठा करके एक इमेजिंग सत्र सेट. एक अक्षुण्ण ऊतक संरचना में छवि टी कोशिकाओं करने के लिए, शुरू की स्थिति आम तौर पर पहली लेबल टी सेल के नीचे 5 से 10 सुक्ष्ममापी पर सेट कर दिया जाता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
इस वीडियो प्रोटोकॉल का अनुसरण करके आप नोड की टी क्षेत्र, एक घटना है कि सामान्य रूप से (चित्र 1) vivo में इस विशेष वातावरण में होता है में जमा फ्लोरोसेंट टी कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में कल्पना की उम्मीद करनी चाहिए. विशेष रूप में, टी कोशिकाओं बी सेल क्षेत्र है, जो आमतौर पर बस के नीचे कैप्सूल से बाहर रखा जाना चाहिए. एक सफल प्रयोग भी ऊतक (चित्रा 2) में भर्ती टी कोशिकाओं में परिणाम होगा एक अत्यधिक गतिशील (चित्रा 3) प्रकाशित बरकरार लिम्फ नोड्स 4 में प्राप्त परिणामों के साथ संगत व्यवहार प्रदर्शित. औसत पर, स्लाइस के भीतर व्यक्तिगत टी कोशिकाओं का मतलब वेग के करीब 10 सुक्ष्ममापी / मिनट (चित्रा 4) होना चाहिए.
चित्रा 1. टी कोशिकाओं लसीका नोड टुकड़ा में जमा fluorescently लेबल टी कोशिकाओं (CMFDA, हरी) छवि अधिग्रहण से पहले एक लसीका नोड टुकड़ा 30 मिनट (ऊपर चित्र) जोड़ा गया . छवि 5 Z दिशा में 50 सुक्ष्ममापी फैले छवियों की अधिकतम प्रक्षेपण है. उज्ज्वल क्षेत्र छवि नीचे में दिखाया गया है. छवियाँ एक widefield खुर्दबीन के साथ कब्जा कर लिया गया.
चित्रा 2. टी कोशिकाओं लसीका नोड टुकड़ा में भर्ती कर रहे हैं fluorescently लेबल टी कोशिकाओं (CMFDA हरा) छवि अधिग्रहण से पहले एक लसीका नोड टुकड़ा 30 मिनट एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करने के लिए जोड़ा गया था. छवियाँ कटौती की सतह (ऊपर चित्र) और 40 सुक्ष्ममापी नीचे (नीचे तस्वीर) पर कब्जा कर लिया गया.
चित्रा 3. टी कोशिकाओं लसीका नोड टुकड़ा के भीतर अत्यधिक गतिशील होते हैं fluorescently लेबल टी कोशिकाओं एक widefield माइक्रोस्कोप का उपयोग 12 मिनट के दौरान imaged किया गया .. व्यक्ति टी कोशिकाओं के trajectories रंग कोडित पटरियों के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं लाल (उच्च गतिशील कोशिकाओं) (कम गतिशील कोशिकाओं) नीले से बढ़ती displacements का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. ट्रैक्स Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना थे. सफेद लाइन नोड के किनारे के बाद, जबकि धराशायी अंडाकार ख्यात बी सेल क्षेत्र delimits.
एक लसीका नोड टुकड़ा के भीतर, चित्रा 4 टी सेल वेग 10 सुक्ष्ममापी / मिनट के करीब है. गति चित्रा 3 में प्रतिनिधित्व पटरियों से Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना थे.
Discussion
हम लसीका नोड स्लाइस, जो शुरू की टी कोशिकाओं के व्यवहार की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है पैदा करने के लिए एक सरल, त्वरित और मजबूत तकनीक वर्णित है. हाल के वर्षों में, इस पद्धति को लागू किया गया है सफलतापूर्वक thymic और लसीका नोड स्लाइस का उपयोग करने के लिए बाह्य कारकों को नियंत्रित टी सेल स्थिति और 1,5 गतिशीलता की पहचान. यह भी सकारात्मक चयन के दौरान और प्रतिजन मान्यता 2,6 पर टी कोशिकाओं में किया गया है thymocytes में Ca 2 + प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए इस्तेमाल किया. उपरिशायी टुकड़ा परख कि चर्चा के काबिल हो फायदे और सीमाएं प्रस्तुत करता है. ध्यान से, इस प्रणाली के ऊतकों को पहुँच परमिट, उपयोगी है अगर एक की जरूरत है स्लाइस में हेरफेर करने के लिए pharmacologically क्रम में सेल प्रवास की आणविक नियंत्रण के साथ हस्तक्षेप. बाद इमेजिंग के लिए, स्लाइस immunohistochemistry के लिए संसाधित किया जा सकता है संरचनाओं कि imaged किया गया है के बारे में अधिक जानकारी इकट्ठा. इसके अलावा, प्रेक्षण एक पारंपरिक widefield प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ किया जा सकता है. हालांकि एक confocal या दो photon एक खुर्दबीन के साथ के रूप में अच्छा संकल्प और नहीं है कि phototoxicity सिद्धांत रूप में है एक फोटोन के साथ दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ तुलना में अधिक गंभीर है, यह सादगी के लाभ, एक कम लागत, और बड़ा विकल्प है उत्तेजना तरंगदैर्य.
एक अक्षुण्ण लिम्फ नोड में टी कोशिकाओं की इमेजिंग लेबल लिम्फोसाइटों के अंतःशिरा इंजेक्शन की आवश्यकता है बाद में lymphoid अंगों के लिए घर है कि. जैसा कि हम एक पहले से पता चला है, टुकड़ा परख दत्तक हस्तांतरण प्रयोग के साथ पूरी तरह से संगत है. हालांकि, लिम्फ नोड्स में घर के लिए टी कोशिकाओं के लिए आवश्यक समय की लंबाई फ्लोरोसेंट रंजक है कि समय के साथ कोशिकाओं के बाहर रिसाव की प्रवृत्ति है का उपयोग जटिल हो सकता है. यह 2 Ca + डाई fura-2 के मामले है. ऊतक में टी कोशिकाओं का तेजी से भर्ती (<30 मिनट) के साथ, टुकड़ा परख ऐसे रंगों का उपयोग करने का अवसर प्रदान करता है. अंत में, इस विधि महान कई मानव ऊतकों में टी सेल कार्यों का विश्लेषण का लाभ रखा जिंदा है.
यह प्रायोगिक प्रणाली भी कि सीमाओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए प्रस्तुत करता है. टुकड़ा करने की क्रिया के साथ जुड़े नुकसान की कटौती की सतह के निकट ऊतक के सतही क्षेत्र में विशेष रूप से टी सेल कामकाज को प्रभावित कर सकता है. आदेश में टुकड़ा के भीतर कोशिका मृत्यु का आकलन करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट डाई SYTOX हरे रंग की है कि समझौता प्लाज्मा झिल्ली के साथ कोशिकाओं प्रवेश किया है. हमारे प्रयोगों से पता चलता है कि कुल नोडल कोशिकाओं, ज्यादातर ऊतक के सतही क्षेत्र में स्थानीयकृत है, के बारे में 20% fluorescently इस परमाणु डाई के साथ लेबल रहे थे. परख के साथ एक अन्य संभावित चिंता स्लाइस chemokines सहित महत्वपूर्ण घुलनशील कारकों को बनाए रखने की क्षमता है. हालांकि, हम कोई संकेत नहीं है कि हमारे डेटा को इस तरह की समस्याओं से प्रभावित थे, के बाद से टी कोशिकाओं टुकड़ा के भीतर एक अच्छा गतिशीलता प्रदर्शन किया है, हम स्वस्थ कटौती की सतह से microns के कई दसियों में स्थित क्षेत्रों में इमेजिंग टी कोशिकाओं के महत्व पर जोर करना चाहते हैं. जबकि, यह इस प्रोटोकॉल में जैसे पारंपरिक सूक्ष्मदर्शी (widefield या confocal) के साथ किया जा सकता है है, यह संभावना है कि लसीका नोड टुकड़ा तैयारी दो photon इमेजिंग गहराई में स्थानिक संकल्प में वृद्धि और phototoxicity कम हो जाएगा के साथ संयुक्त.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों डॉ. एलेन Trautmann जो हमें लसीका नोड स्लाइस प्रदर्शन करने के लिए प्रोत्साहित किया धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में लीग Nationale Contre ले कैंसर, Fondation डालना ला Recherche MEDICALE एन फ्रांस और एसोसिएशन डालना ला सभ्य सुर ले कैंसर से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | Any Supplier | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
References
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. , (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
