Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لخلايا T الفلورسنت عرض الصور الى شرائح العقدة الليمفاوية. هذه التقنية تسمح في الوقت الحقيقي والتحليلات للهجرة الخلايا التائية مع مضان widefield التقليدية أو المجاهر مبائر.
Abstract
الخلايا التائية السذاجة المرور بشكل مستمر لأجهزة اللمفاوية الثانوية ، بما في ذلك الغدد الليمفاوية الطرفية ، لكشف المستضدات النادرة التي أعرب عنها. الهجرة من خلايا تي في الغدد الليمفاوية هو عملية معقدة تنطوي العوامل الخلوية والكيميائية بما في ذلك chemokines. في الآونة الأخيرة ، سمح استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتعقب الخلايا التائية في الغدد الليمفاوية وسليمة للحصول على بعض المعلومات الكمية على سلوكهم وتفاعلها مع الخلايا الأخرى. في حين أن هناك مزايا واضحة الى النظام في الجسم الحي ، وهذا النهج يتطلب أجهزة معقدة ومكلفة ، ويوفر فرص محدودة في الأنسجة. لتحليل سلوك الخلايا التائية داخل الغدد الليمفاوية الفئران ، وضعنا مقايسة شريحة 1 ، وضعه في الأصل من قبل علماء بيولوجيا الأعصاب ونقلها مؤخرا إلى التوتة الفئران 2. في هذه التقنية ، يتم مطلي الخلايا التائية fluorescently المسمى على أعلى شريحة العقدة اللمفية مستعدة تماما. في هذه المقالة عن طريق الفيديو ، ويتم تحليل والتوطين والهجرة من خلايا تي في الأنسجة في الوقت الحقيقي مع widefield ومبائر المجهر. الأسلوب الذي يكمل في الجسم الحي اثنين الفوتون المجهري يقدم نهجا فعالا لخلايا T صورة في بيئتها الطبيعية ، وتوضيح الآليات الكامنة وراء الهجرة تي الخلية.
Protocol
1. إعداد شرائح من العقد الليمفاوية
- إعداد 4 ٪ منخفضة ذوبان agarose حل لتضمين نقطة. تمييع agarose في حل هذا برنامج تلفزيوني والميكروويف. عندما يذوب تماما agarose ، والحفاظ على الحل عند 37 درجة مئوية لتصبح جاهزة للاستخدام.
- تعد زراعة الأنسجة 6 - جيدا لوحة. إضافة 1.1 مل RPMI مستنبت الكامل لكل بئر ، وإدراج مرشح عضوي النمط في كل بئر. مكان لوحة 6 - جيدا في 4 درجات مئوية حتى على استعداد لنقل الشرائح.
- مكان غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ ، مع بأقطار داخلية من 4 ملم ، في طبق من البلاستيك مملوءة المتوسطة RPMI كاملة. وسيتم استخدام غسالات مزيد من التركيز على الخلايا على شريحة قطع vibratome.
- التضحية الماوس وفقا للوائح المحلية الرفق بالحيوان. إزالة بعناية الغدد الليمفاوية الطرفية من الأنسجة المحيطة بها ووضعها في صحن من البلاستيك تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. ويجب الحرص على عدم الاضرار بنية العقدة الليمفاوية ، وهذه الأجهزة هي لينة جدا.
- صب 4 ٪ ، agarose هلام في طبق بلاستيكي 35 ملم ونقل بدقة العقد الى هلام. مغادرة agarose هلام على الجليد لمدة 5 دقائق لتتصلب.
- إزالة كتلة من الطبق وتقليم آغار من أجل ترك 3-5 ملم من الجل حول كل العقدة الليمفاوية.
- نعلق العقد جزءا لا يتجزأ من على القرص عينة من الأنسجة vibratome مع الغراء غير سامة. تثبيت القرص العينة في علبة مليئة الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
- القسم جزءا لا يتجزأ من نسيج أغار على سماكة 320 ميكرون مع سرعة vibratome مجموعة على مجموعة بطيئا (0.3 مم / ثا) وتواتر الاهتزاز تعيين على المدى المتوسط (1.5 ملم).
- نقل بعناية شرائح العقدة الليمفاوية كما يجري قطعوا يدرج على ثقافة عضوي النمط باستخدام الملقط الغرامة. 3 شرائح مكان على كل إدراج. استخدام عناية كبيرة كما يمكن أن شرائح تلف بسهولة. سوف نموذجي العقدة الليمفاوية الطرفية العائد 5 أقسام عندما قطع في 320 ميكرون. تجاهل الشرائح الأولى والأخيرة ، لأنها تحتوي فقط على الأنسجة السطحية.
- مكان غسالات الفولاذ المقاوم للصدأ على كل شريحة على حدة. تأكد من وضع جيد غسالات على agarose المحيطة الأنسجة.
- لوحة احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة 5 ٪ CO 2 مرطب حتى جاهزة للخلايا T لوحة.
2. عزل خلايا تي من الغدد الليمفاوية الماوس
- عزل خلايا T وفقا للمادة 3 إن الرب المنشورة سابقا.
- استخدام الخلايا التائية فورا والشروع في المقطع التالي. خلاف ذلك ، قد يكون مثقف الخلايا الليمفاوية بين عشية وضحاها في إكمال RPMI المتوسطة تستكمل مع 10 نانوغرام / مل IL - 7.
3. توسيم الخلايا التائية معزولة
- غسل الخلايا في HBSS. Resuspend لهم في المنطقة العازلة نفسها في 10 6 10 س في مل.
- إضافة نفس الحجم من HBSS يحتوي على 1 ميكرومتر المقتفي الخلية الخضراء CMFDA إعطاء تركيز النهائي من 0.5 ميكرومتر.
- احتضان تعليق خلية عند 37 درجة مئوية خلال 5 دقائق. تغسل مرتين مع خلايا كاملة RPMI المتوسط.
- Resuspend الخلايا بتركيز نهائي من 10 6 10 س في مل في إكمال RPMI المتوسط. وسيتم مطلي هذه الخلايا المسمى على الشرائح.
قد تستخدم الأصباغ الفلورية الأخرى من CMFDA جدا ، ولكن نأخذ في الاعتبار أن هذه الجزيئات يمكن أن تكون سامة فوق تركيزات معينة.
4. طلاء الخلايا التائية المسمى على شرائح العقدة الليمفاوية
- إزالة الزائدة المتوسطة الواردة في الجزء الداخلي من غسالة مع ماصة. لا تسمح لتصبح الأنسجة الجافة ، والعمل سريعا من خلال هذه الخطوة.
- الاستغناء بلطف 10-20 خلايا T ميكرولتر المسمى الذي يطابق إلى 1 ل2 × 5 10 الخلايا في الجزء الداخلي من غسالة. ويجب الحرص على عدم لمس الأنسجة مع غيض من ماصة. تأكد من أن قطرة من تعليق الخلية يبقى في مكانه.
- مكان شرائح مع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 على الأقل 30 دقيقة للسماح للهجرة الخلايا الليمفاوية في الأنسجة.
5. التصوير داخل الخلايا التائية شرائح العقدة الليمفاوية
في هذه المقالة عن طريق الفيديو ، ونحن خلايا T الفلورية في صورة شرائح العقدة الليمفاوية تحت المجهر widefield مقلوب ومبائر المجهر تستقيم.
- ضبط درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية. المجاهر مجهزة لدينا مع درجة الحرارة التي تسيطر عليها الغرف.
- تثبيت نظام نضح نضح تمكين المستمر لشريحة العقدة الليمفاوية مع (5 ٪ CO 2 ، 95 ٪ O 2) الفينول الاوكسيجين المتوسطة RPMI الحمراء الخالية. في نظامنا ، ووسائل الإعلام perfused يدخل الى غرفة التصوير من جانب واحد عن طريق الجاذبية. ويستنشق المتوسط مع مضخة متصلة جمع النفايات القارورة. ضبط معدل تدفق وسائل الاعلام الى 1 مل / دقيقة.
- ملقط مع الغرامة ، واتخاذ بدقة من شريحة من لوحة 6 - جيدا وتراجع في إعداد حرارة متوسطة RPMI الاوكسيجين لبضع ثوان للتخلص من الخلايا الفلورسنت لا تسللوا إلى الأنسجة.
IMAجينج الخلايا التائية مع المجهر واسعة المجال المقلوب
- ضع شريحة رأسا على عقب على غرفة مخصصة التصوير الصنع التي تتكون من خيوط النايلون لصقها على الجزء الداخلي من وعاء زجاجي القاع. في هذه القاعة ، وخيوط النايلون رفع شريحة من الزجاج ، وتمكين الحل لنزع فتيل الاوكسيجين في الأنسجة. هذا أمر مطلوب والهجرة تي خلية في الغدد الليمفاوية وتعتمد بشدة على الأوكسجين. تأمين شريحة بإضافة على أنه غسالة الفولاذ المقاوم للصدأ. في ظل هذه الظروف ، فإن شريحة تقع بضعة ميكرونات فوق قاع الطبق ، مما يسهل تجديد حل الارواء.
- للقبض على حقل كبير للعرض (800 × 800 ميكرون ، ما يقرب من ثلث مساحة شريحة العقدة) ، وجمع الصور باستخدام عدسات 10X الهدف الجافة. وجدنا أن 10X نيكون S ثر 0.5 NA كان الأكثر ملاءمة لتحليلاتنا.
تجربة نموذجية الوقت الفاصل بين التصوير تلتقط 5 طائرات البصرية التي تمتد على عمق ما مجموعه 50 ميكرومتر في البعد (ض) المحوري. يتم تصويرها عادة الفلورسنت الخلايا التائية على فترات تتراوح بين 10-30 ثانية خلال 10-20 دقيقة.
تصوير الخلايا التائية مع المجهر تستقيم مبائر
المجهر مبائر المستخدمة في هذا البروتوكول هو SP5 ايكا مجهزة الهدف مياه الغمر 20X (أوليمبوس ، 20x/0.95 NA).
- تأمين شريحة إلى مرحلة التصوير من المجهر. ملاحظة : نحن نضع عادة غسالة على إعداد لشل حركة عليه.
- تعيين جلسة التصوير عن طريق جمع سلسلة من الصور على طول المحور z. صورة لخلايا تي في بنية الأنسجة سليمة ، يتم تعيين وعادة ما تبدأ في موقف 5-10 ميكرون أسفل الخلية الأولى المسماة تي.
6. ممثل النتائج
باتباع هذا الفيديو البروتوكول ينبغي أن تتوقع أن تصور عدد كبير من الخلايا التائية الفلورسنت المتراكمة في منطقة T من العقدة ، وهي الظاهرة التي تحدث عادة في هذه البيئة ولا سيما في الجسم الحي (الشكل 1). على وجه الخصوص ، ينبغي استبعاد الخلايا التائية من مناطق الخلية B ، والتي عادة ما تكون فقط تحت الكبسولة. وهناك تجربة ناجحة نتيجة أيضا في الخلايا التائية تجنيدهم في الأنسجة (الشكل 2) ، وعرض السلوك متحركة عالية (الشكل 3) بما يتفق مع النتائج المنشورة التي تم الحصول عليها في العقد اللمفاوية سليمة 4. في المتوسط ، يجب أن يعني السرعة من الخلايا التائية الفردية داخل شرائح تكون قريبة إلى 10 ميكرون / دقيقة (الشكل 4).
الشكل 1. تتراكم الخلايا التائية الليمفاوية في شريحة العقدة. أضيفت Fluorescently المسمى خلايا T (CMFDA ، الأخضر) إلى 30 دقيقة العقدة الليمفاوية شريحة قبل الحصول على الصور (صورة أعلى). كانت الصورة الإسقاط أقصى 5 ميكرون الصور التي تغطي 50 في اتجاه ض. يظهر صورة مشرقة في الحقل السفلي. والتقاط الصور مع المجهر widefield.
الشكل 2. ويتم تجنيد الخلايا اللمفية تي في شريحة العقدة. أضيفت Fluorescently المسمى خلايا T (CMFDA ، الأخضر) إلى 30 دقيقة العقدة الليمفاوية شريحة قبل الحصول على الصور باستخدام المجهر مبائر. والتقاط الصور على سطح قطع (صورة أعلى) و 40 ميكرومتر أدناه (صورة القاع).
الشكل 3. الخلايا التائية هي متحركة عالية ضمن شريحة عقدة الليمفاوية ، وتم تصوير الخلايا التائية التي تحمل علامات Fluorescently خلال 12 دقيقة باستخدام المجهر widefield. يتم عرض المسارات من الخلايا التائية المسارات الفردية وترميز الألوان لتمثيل النزوح المتزايد من الأزرق (خلايا متحركة منخفض) إلى (خلايا متحركة عالية) الحمراء. حسبت المسارات باستخدام برنامج Imaris. الخط الأبيض يلي حافة عقدة ، في حين أن يحد البيضاوي متقطع الخلية المفترضة B المنطقة.
الشكل 4. غضون الليمفاوية شريحة عقدة ، وسرعة الخلايا التائية ، على مقربة من 10 ميكرون / دقيقة. حسبت بسرعة باستخدام البرمجيات Imaris من المسارات ممثلة في الشكل 3.
Discussion
وقد وصفت لدينا مباشرة ، وتقنية سريعة وقوية لتوليد شرائح العقدة الليمفاوية ، والتي تستخدم للتحقيق في سلوك الخلايا التائية قدم. في السنوات الأخيرة ، وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح باستخدام التوتة وشرائح العقدة الليمفاوية لتحديد العوامل خارج الخلية السيطرة على الخلية وتحديد المواقع تي 1،5 حركية. كما تم استخدامه لقياس الكالسيوم 2 + الردود في أثناء اختيار thymocytes إيجابية في الخلايا التائية وعند الاعتراف مستضد 2،6. وفحص شريحة تراكب يقدم مزايا والقيود التي تستحق أن تناقش. من الملاحظة ، وهذا النظام يسمح بالوصول إلى الأنسجة ، مفيدة إذا كان أحد يحتاج إلى معالجة شرائح عقاقيري من أجل التدخل في مكافحة الهجرة الجزيئي للخلايا. بعد التصوير ، ويمكن معالجة المناعية للشرائح لجمع مزيد من المعلومات عن الهياكل التي تم تصويرها. وعلاوة على ذلك ، يمكن إجراء المراقبة مع المجهر مضان widefield التقليدية. رغم ان القرار ليست جيدة كما مع مبائر أو مجهر ثنائي الفوتون ، وأنه من حيث المبدأ الضيائية أكثر شدة مع فوتون واحد من اثنين مع المجهري الفوتون ، لها مزايا البساطة ، وأقل تكلفة ، وأكبر الاختيار موجات من الإثارة.
التصوير من خلايا تي في العقدة الليمفاوية سليمة يتطلب الحقن في الوريد من الخلايا الليمفاوية المسمى ذلك المنزل في وقت لاحق إلى الأجهزة اللمفاوية. كما بينا سابقا 1 ، وفحص شريحة متوافقة تماما مع تجربة نقل بالتبني. ومع ذلك ، يمكن لطول الفترة الزمنية اللازمة للخلايا T إلى منزل في الغدد الليمفاوية تعقيد استخدام الأصباغ الفلورية التي لديها ميل إلى تسرب الخلايا مع مرور الوقت. هذا هو حال كا 2 + صبغ fura - 2. مع توظيف سريع (<30 دقيقة) من خلايا تي في النسيج ، وفحص شريحة يوفر فرصة لاستخدام هذه الأصباغ. أخيرا ، فإن هذا الأسلوب له ميزة كبيرة لتحليل وظائف الخلية تي في الأنسجة البشرية عدة أبقى على قيد الحياة.
ويعرض هذا النظام التجريبي أيضا القيود التي تحتاج إلى أن توضع في الاعتبار. قد يؤدي إلى تلف المرتبطة تشريح تؤثر T أداء الخلية ، وخصوصا في المنطقة السطحية من الأنسجة بالقرب من سطح قطع. من أجل تقييم موت الخلايا داخل شريحة ، وقد استخدمنا الفلورية الخضراء SYTOX الصبغة التي تخترق خلايا غشاء البلازما مع خطر. تجاربنا التي كانت تكشف عن fluorescently المسمى حوالي 20 ٪ من مجموع الخلايا العقدية ، مترجمة في معظمها في المنطقة السطحية من الأنسجة ، وهذه الصبغة النووية. قلق آخر محتمل مع مقايسة هو قدرة الشرائح على الاحتفاظ بما في ذلك العوامل الهامة للذوبان chemokines. على الرغم من أنه ليس لدينا أي دليل على أن تأثرت البيانات المتوفرة لدينا من مشاكل من هذا النوع منذ الخلايا التائية عرض حركية جيدة داخل شريحة ، نود أن نؤكد على أهمية الخلايا T التصوير في المناطق الصحية التي تقع في عشرات ميكرون من سطح قطع. في حين ، ويمكن القيام بذلك مع المجاهر التقليدية (أو widefield مبائر) في مثل هذا البروتوكول ، فمن المرجح أن شريحة العقدة الليمفاوية إعداد مجتمعة مع اثنين من الفوتون التصوير سوف يزيد من عمق في التحليل المكاني والحد من الضيائية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور آلان تراوتمان الذي شجعنا على أداء شرائح العقدة الليمفاوية. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من الدوري الفرنسي لمكافحة السرطان الوطني كونتر جنيه ، ومؤسسة بحوث من أجل لا ميديكال ان فرنسا وتصب جمعية بحوث السرطان لا سور جنيه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | Any Supplier | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
References
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. , (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
