Summary
这个协议描述了一种方法引入到淋巴结切片的荧光图像的T细胞。该技术允许传统的宽视场荧光或共聚焦显微镜的实时分析，T细胞迁移。
Abstract
幼稚T细胞不断交通次级淋巴器官，包括周边的淋巴结，发现罕见表达的抗原。 T细胞迁移到淋巴结是一个复杂的过程，它涉及包括趋化因子的细胞和化学因素。近日，双光子显微镜的使用已获准跟踪完整的淋巴结中的T细胞，并从中对他们的行为和它们之间的相互作用的一些定量信息与其他细胞。虽然有明显的优势，在体内系统，这种方法需要一个复杂的和昂贵的仪器和组织提供有限的访问。要分析小鼠淋巴结中的T细胞的行为，我们已经开发出一个切片检测1，最初成立由神经生物学家最近调换到小鼠胸腺2。在这种技术中，荧光标记的T细胞被镀上敏锐地准备的淋巴结切片的顶部。在这个视频，文章，本地化和T细胞迁移到组织中的实时分析与广角和共聚焦显微镜。技术，补充体内的双光子显微镜图像的T细胞提供了一个有效的方法在自然环境中，并阐明T细胞迁移的内在机制。
Protocol
1。从淋巴结准备片
- 准备4％低熔点琼脂糖溶液嵌入。琼脂糖稀释在PBS和微波这个解决方案。当琼脂糖完全溶解，保持在37 ° C，直到准备使用的解决方案。
- 准备一个6孔组织培养板。加入1.1毫升每口井的RPMI完全培养液，并插入在每口井器官的过滤器。 6孔板放置在4 ° C，直到准备转让片。
- 广场不锈钢垫圈，内径为4毫米，为填充用RPMI完全培养基一个塑料盘。垫圈将进一步集中vibratome切割片上的细胞。
- 鼠标在根据当地的动物福利法规牺牲。小心地从周围组织的外周淋巴结和他们在一个塑料盘含冰冷PBS的地方。必须小心不损坏淋巴结结构，因为这些器官都非常柔软。
- 倒入一个35毫米的塑料盘的4％琼脂糖凝胶电泳和微妙的凝胶转移到节点。留在冰上5分钟硬化的琼脂糖凝胶。
- 从盘中取出块，并以凝胶3-5毫米左右离开每个淋巴结修剪琼脂。
- 附加标本无毒组织胶vibratome磁盘上的嵌入式节点。安装在弥漫着冰冷的PBS托盘的标本磁盘。
- 科琼脂嵌入式vibratome一个缓慢的范围上设置的速度（0.3毫米/秒）和一个中程（1.5毫米）上设置的振动频率在320μm厚的组织。
- 小心转移淋巴结切片，因为他们正在削减到的器官文化，用细镊子插入。放置在每个插入3片。使用非常谨慎，作为片可以很容易损坏。一个典型的周围淋巴结将削减产量5节时，在320微米。放弃第一个和最后一个切片，因为它们只包含浅表组织。
- 每一个人的片上放置不锈钢垫圈。确保垫圈定位以及对周围组织琼脂糖。
- 培养板在37 ° C直到准备板T细胞在5％ 二氧化碳培养箱。
2。隔离从小鼠淋巴结T细胞
- 根据先前公布的朱庇特的第3条隔离T细胞。
- 立即使用的T细胞，并继续下一节。否则，可能是淋巴细胞培养过夜在10 ng / ml的IL - 7为辅的完整的RPMI介质。
3。孤立的T细胞的标签
- 在HBSS中清洗细胞。重悬在每毫升10 × 10 6相同的缓冲区。
- 加入相同体积的含有1微米的细胞跟踪绿色CMFDA给予终浓度为0.5微米的HBSS。
- 在37 ° C在5分钟的细胞悬液。完全RPMI培养基洗涤细胞两次。
- 在终浓度为每毫升10 × 10 6完全RPMI培养基悬浮细胞。这些标记的细胞，将被镀上的切片。
比CMFDA其他荧光染料可能被使用过，但要记住，这些分子有可能超过一定浓度的有毒。
4。电镀标记的T细胞到淋巴结切片
- 用移液器洗衣机的内部部分中除去多余的介质。不要让组织变得干燥;工作迅速在这一步。
- 轻轻免除10％至20μL标记的T细胞，对应于1至2 × 10 5细胞在洗衣机内的一部分。必须小心，不要触摸吸管尖的组织。确保停留在细胞悬液下降。
- 放置培养箱中培养细胞切片在37 ° C和5％的CO 2至少30分钟，让淋巴细胞迁移到组织。
5。成像T细胞在淋巴结切片
在这个视频文章中，我们用广角倒置显微镜和共聚焦直立显微镜的淋巴结切片图像荧光T细胞。
- 温度设定在37 ° C。我们的显微镜都配有温度控制箱。
- 安装灌注系统，能够连续灌注含氧（5％CO 2，O 2的95％）无酚红的RPMI培养基的淋巴结切片。在我们的系统，灌流媒体从一个侧面受重力进入到成像室。介质与泵的连接到一个废物收集瓶中吸气。设置媒体流速为1毫升/分钟。
- 用细镊子，微妙拿出从6孔板切片，浸在回暖含氧的RPMI中等几秒钟，以获得摆脱不渗透进入组织的荧光细胞的准备工作。
IMA蔓茎与T细胞的一个宽领域的倒置显微镜
- 将片上粘到玻璃底部盘内的尼龙线组成的一个特制的成像室倒挂。在这个会议厅内，尼龙线提升玻璃切片，使氧扩散到组织的解决方案。淋巴结的T细胞迁移是强烈地依赖氧气，这是必需的。安全切片，加入到它的不锈钢垫圈。在这种情况下，切片在于以上的菜，这有利于延续灌注液底部几微米。
- 要捕获的大视场（800 × 800微米，一个节点的片表面的约三分之一），采集图像，使用10倍的干物镜。我们发现，尼康10X小号福陆公司0.5 NA是最适合我们的分析。
一个典型的时间推移成像实验捕获5，涵盖了总深度在轴向（Z）尺寸50微米的光飞机。荧光T细胞通常成像范围在10至20分钟10到30秒的时间间隔。
直立共聚焦显微镜成像T细胞
在本议定书中所使用的激光共聚焦显微镜是徕卡配备20倍水浸泡的目的（奥林巴斯，20x/0.95 NA）的SP5的。
- 片固定在显微镜的成像阶段。注：我们通常放在编制固定垫圈。
- 设置收集了一系列的图像沿Z轴的成像会议。在一个完整的组织结构图像的T细胞，起始位置通常是在下面的第一个标记的T细胞的5至10微米。
6。代表性的成果
通过下面这个视频协议，你应该预料到一个节点的T区，这种现象通常发生在这特定的环境中体内（图1）中积累的荧光性T细胞的大量可视化。尤其是T细胞，B细胞区，下方胶囊通常应排除。一个成功的实验，也将导致进入组织招募的T细胞（图2），显示高度能动的行为（图3）与公布的结果获得完整的淋巴结肿大4一致。平均而言，片内的个人T细胞的平均流速应接近10微米/分钟（图4）。
图1。 T细胞聚集在淋巴结切片。淋巴结切片图像采集前30分钟（上图片），分别加入荧光标记的T细胞（CMFDA绿色） 。形象是最大的5跨越50微米，在z方向的图像投影。明场图像显示在底部。与宽视场显微镜图像捕获。
图2。 T细胞被招入一个淋巴结切片 ，淋巴结切片图像采集前30分钟，使用共聚焦显微镜，分别加入荧光标记的T细胞（CMFDA绿色）。在切割面（上方照片）和40微米以下（下图）的图像被抓获。
图3。 T细胞是高度能动内淋巴结切片 ，荧光标记的T细胞在12分钟用一个宽视场显微镜成像。个别T细胞的轨迹显示颜色编码的轨道，代表从蓝色（低游动细胞），红色（高游动细胞）增加位移。轨道计算Imaris软件。白线以下的边缘节点，而虚线椭圆划定的公认的B细胞区。
图4：在一个淋巴结切片，T细胞的速度接近10微米/分钟。从图3中的代表曲目Imaris软件计算的速度。
Discussion
我们已经描述了一个简单，快速和强大的技术产生淋巴结切片，这是用来调查推出的T细胞的行为。近年来，这种方法已经被成功应用胸腺和淋巴结切片识别控制T细胞的定位和运动1,5的细胞外因素。它也被用来在积极选择和T细胞抗原识别2,6时的胸腺细胞的Ca 2 +反应来衡量。覆盖切片检测的优势和局限，值得讨论。值得注意的是，这个系统允许访问的组织，有用的，如果需要操纵片药理学，以干扰与细胞迁移的分子控制。成像后，可切片进行免疫组化处理，以收集对已成像结构的进一步信息。此外，可与传统的宽视场荧光显微镜观察。虽然分辨率不如共聚焦或双光子显微镜，光毒性，原则上是更严重的单光子双光子显微镜，它具有简单的优势，以较低的成本和更大的选择，激发波长。
一个完整的淋巴结中的T细胞成像需要静脉注射标记的淋巴细胞，淋巴器官，随后回家。正如我们以前1所示，切片化验继转移实验是完全兼容的。然而，T细胞进入淋巴结家庭所需的时间长度，可以使用荧光染料，有一种倾向，泄漏的细胞，随着时间的推移变得复杂。这是的Ca 2 +染料FURA - 2的情况下。快速招聘到组织的T细胞（<30分钟），切片检测提供了一个机会使用这些染料。最后，这种方法具有很大的优势分析在几个人体组织中的T细胞功能，更让。
这个实验系统介绍也需要牢记的限制。与切片相关的损害可能影响T细胞的功能，尤其是在表面的切割面附近的组织区域。为了评估在切片的细胞死亡，我们用荧光染料SYTOX绿色，穿透细胞受损的细胞膜。我们的实验表明，约20％，总的淋巴结细胞，大多定位在肤浅的地区组织，这个核染料荧光标记。检测的另一个潜在的问题是能否留住重要的可溶性因子包括趋化因子的切片。虽然，我们没有任何迹象显示，我们的数据等问题的影响，因为T细胞内片显示良好的蠕动，我们想强调的成像T细胞在位于从切面的几十微米的健康地区的重要性。然而，这可能是与传统的显微镜，如在本议定书（广角或焦），它是可能的淋巴结切片准备，结合双光子成像深度将增加空间分辨率和降低光毒性。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢阿兰博士Trautmann鼓励我们进行淋巴结切片。这项工作是支持部分由法甲国立CONTRE LE癌症基金会POUR LA RECHERCHE Médicale EN法国和协会LA RECHERCHE河畔乐癌症的赠款。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Fine Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| 30 mm Culture inserts | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | Any Supplier | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
References
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