Summary
Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי מנצל את שרשרת התגובה פולימראז (PCR), אשר הוקמה כשיטת הבחירה של רגישות גבוהה לגילוי של זיהום Mycoplasma, Acholeplasma ו Ureaplasma בתרביות תאים והתרבות תאים אחרים הנגזרים ביולוגיות.
Abstract
תחזוקה של זיהום ללא שורות תאים חיוני מחקר מבוססי תאים. בין החששות הגדולים ביותר הם זיהום זיהום mycoplasma. למרות mycoplasma בדרך כלל לא להרוג תאים נגועים, הם קשים לאיתור יכול לגרום למגוון של השפעות על תאים בתרבית, כולל חילוף החומרים משתנה, האט התפשטות סטיות כרומוזומליות. בקיצור, זיהום mycoplasma פשרות את הערך של שורות תאים אלה במתן נתונים מדויקים על המחקר במדעי החיים.
מקורות זיהום mycoplasma במעבדה הם מאוד מאתגר לשלוט לחלוטין. כמו מינים מסוימים mycoplasma נמצאים על העור האנושי, הם יכולים להיות הציג באמצעות טכניקה aseptic עניים. בנוסף, הם יכולים לבוא תוספי מזון מזוהם כמו בסרום שור עוברית, והכי חשוב משאר תרביות תאים נגועים. לאחר mycoplasma מזהם תרבות, היא יכולה להתפשט במהירות לזהם באזורים אחרים במעבדה. ההקפדה על נהלי מעבדה טובים כמו טכניקה aseptic טובים מפתח, בדיקה שגרתית עבור mycoplasma מומלץ מאוד לשליטה מוצלחת של זיהום mycoplasma.
PCR מבוססי זיהוי של mycoplasma הפכה שיטה פופולרית מאוד לצורך תחזוקה שגרתית בתא קו. PCR מבוססות שיטות הזיהוי רגישים מאוד והוא יכול לספק תוצאות מהירות, המאפשר לחוקרים כדי להגיב במהירות כדי לבודד ולמנוע זיהום לאחר שהוא זוהה לעומת הזמן הנדרש באמצעות טכניקות מיקרוביולוגיות. Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי רגיש ביותר, עם הגבלה זיהוי של רק 2 הגנום לכל μl. ניצול של פולימראז מאוד ספציפיות תקי DNA JumpStart ועיצוב פריימר קניינית, חיוביות שגויות מופחתים מאוד. הפורמט נוח 8-צינור, רצועות מראש מצופה dNTPs, הקשורים primers עוזר להגדיל את התפוקה כדי לענות על הצרכים של הלקוחות עם אוספים גדולים של שורות תאים.
לאור רגישות קיצונית של הערכה, בזהירות רבה יש לנקוט על מנת למנוע זיהום מכוונת של דגימות ריאגנטים. פרוטוקול צעד אחר צעד אנחנו מדגימים מדגיש את אמצעי הזהירות והנהלים הנדרשים לאיתור mycoplasma אמין. אנחנו גם מראים ולדון בתוצאות טיפוסי הפרשנות שלהם. המטרה שלנו היא להבטיח את הצלחת החוקרים באמצעות Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי.
Protocol
1. Mycoplasma איתור
- תרבות supernatants סלולרי ניתן לבדוק באופן ישיר או המדגם יכול מוכן לשימוש במועד מאוחר יותר. כדי להכין לשימוש מאוחר יותר במקום 100 μl של supernatant בתוך שפופרת הגברה דגירה סטרילית על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. ברגע זה הוא להשלים את המדגם ניתן לאחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס עד שבוע. רק לפני הפעלת צנטריפוגות מדגם בקצרה (5 שניות) על גלולה כל פסולת הסלולר.
- כדי להכין את דגימות ה-PCR, לקבוע את הנפח הכולל של המאגר Jumpstart תקי DNA פולימראז / התייבשות הדרושים התגובות. אנחנו נהיה הכנת 5 תגובות מוחלטת. חמש תגובות ידרוש 2.5μl של תקי ו 114.5μl של חיץ להחזרת נוזלים. זה יכיל לפחות יחידה אחת של תקי לכל התגובה 22.5μl של חיץ התייבשות לכל תגובה מדגם שליטה שלילי בתוספת 24.5μl של חיץ התייבשות לשליטה חיובית. 1 יחידה של פולימראז ה-DNA לכל תגובה יש להוסיף נפח מתאים של חיץ להחזרת נוזלים. זה ישתנה עם תקי בשימוש.
- מניחים את נפח מחושב של פולימראז הדנ"א תקי לתוך צינור microcentrifuge נקי ופעל עם נפח המחושב של חיץ להחזרת נוזלים. המאגר פולימראז / התייבשות DNA צריכה להיות מעורבת על ידי מצליף בעדינות את הצינורית. תערובת זו לא צריכה להיות vortexed.
- כדי להכין את הביקורת השלילית דגימות להשתמש צינורות התגובה שקוף המסופק בערכה. צינורות התגובה המסופק בערכה כבר מכילים את nuclueotides, primers ו-DNA הבקרה הפנימית. 23 μl של Jumpstart לערבב תקי פולימראז / Rehydration למאגר הדנ"א, מוכן כמו בשלבים הקודמים, צריך להיות ממוקם בכל אחד לשלוט שלילי דוגמיות. הוסף 2 μl מים DNA חופשיים לשלוט שלילי ולהוסיף 2 μl של המדגם לכל אחד הצינורות מדגם התווית. מערבבים את תכולת מצליף על ידי צינורות. תוכן לא צריכה להיות vortexed.
- כדי להכין את השליטה חיובי להשתמש צינורות התגובה ורוד המסופק בערכה. צינורות התגובה המסופק בערכה כבר מכילים את nuclueotides, primers ו-DNA הבקרה הפנימית. הוסף 25 μl של Jumpstart לערבב תקי פולימראז / Rehydration DNA חיץ, מוכן כמו בשלבים הקודמים, את צינורות התגובה התווית. מערבבים את תכולת מצליף על ידי צינורות. תוכן לא צריכה להיות vortexed. דגירה שליטה שלילית, שליטה חיובית דוגמיות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- עבור PCR כדי לקחת את המקום דגימות את הצורך להציב Cycler תרמית. בעת שימוש JumpStart תקי צעד הפעלה אינה נדרשת. מניחים את צינורות התגובה Cycler התרמית. מחזורי צריך להיות מוגדר כדלקמן: 94 ° C למשך 30 שניות, 55 ° C למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך 40 שניות. מחזורים אלה ינוהלו 40 פעמים.
- לאחר מחזורי PCR השלימו דוגמאות צריך להיות מקורר 4-8 מעלות צלזיוס על ידי הוצאתם Cycler תרמי הכנסתם קרח. כאשר הדגימות התקררו הם צריכים להיות הועמסו על הג'ל agarose עבור אלקטרופורזה. ג'ל טוען וצבע אינם נחוצים כפי שהם כבר נוכח צינורות התגובה. ישירות לטעון 8 μl לכל PCR למסלול נפרד. עצור את אלקטרופורזה לאחר ההגירה של 2.5-3.0 ס"מ.
2. נציג תוצאות
השליטה שלילי צריך להראות להקה של כ 481 נ"ב. ניתן לראות זאת בעמודה בקרה שלילית על ג'ל אלקטרופורזה, אשר מוצג בתחילת הסרטון. היעדרם של הלהקה בקרה שלילית על 481 נ"ב הוא אינדיקטור טוב כי פעילות של פולימראז לא היה בשימוש sufficienttaq לא היה רגיש מספיק.
דגימות חיוביות Mycoplasma יציג להקות בטווח של 270 ± 8 נ"ב. הלהקה יהיה כבד על דגימות מזוהמות מאוד חלש עבור דגימות מזוהמות קלות. וריאציות בעוצמת ניתן לראות את העמודות מדגם חיובית על ג'ל אלקטרופורזה, אשר מוצג בתחילת הסרטון. כל הדגימות מכילות פקד שלילי פנימי על מנת להוכיח כי PCR התרחש כצפוי. זה נורמלי לראות את היעדר הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות מאוד.
אם אין להקה בטווח חיובי או להקה בטווח שלילית על מדגם שלך זה הוא אינדיקטור טוב כי דגימות שלך עכבות. אם המדגם הוא עכבות מעכבי PCR ניתן להסיר על ידי ביצוע מיצוי DNA.
. איור 1 להקות Amplicon רלוונטיים: תוצאות של גילוי mycoplasma על ידי PCR מוצגים. ליין 2 הוא שליטה שלילי, שאמורה להראות להקה של כ 481 נ"ב. היעדרם של הלהקה בקרה שלילית על 481 נ"ב הוא אינדיקטור טוב כי השתמשו תקי לא היה רגיש מספיק. Mycoplasma חיובי דגימות יציג להקות בטווח של 270 + 8 נ"ב כפי שמוצג נתיבים 3-6. הלהקה יהיה heaVY עבור דגימות מזוהמות ביותר (נתיב 6), קלוש עבור דגימות מזוהמות קלות (מסלול 4). כל הדגימות מכילות פקד שלילי פנימי (481 נ"ב) על מנת להוכיח כי PCR התרחש כצפוי. זה נורמלי לראות את היעדר הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות מאוד.
Discussion
בגלל הרגישות הקיצונית של הערכה, כאשר היא מבוצעת כהלכה הערכה צריכה להניב תוצאות מדויקות המציין אם המדגם שלך יש זיהום mycoplasma. הערכה כבר מותאם לשימוש עם ה-DNA פולימראז תקי JumpStart. Taqs אחרים ניתן להשתמש בעת הכנת הדגימות אבל הלהקה הבקרה הפנימית על 481 נ"ב צריכים להיות נוכחים כדי לציין רגישות ראויה של תקי חלופיים. זה אפשרי עבור הלהקות חיובי להציג צפיפויות שונות בהתאם לרמת הזיהום. אפשר לראות את העדרו של הלהקה הבקרה הפנימית על דגימות מזוהמות בכבדות. באמצעות טכניקה נכונה זהירות בעת הכנת הדגימות על מנת למנוע זיהום הם קריטיים עבור הנכונה. זיהוי בעת שימוש Mycoplasma Lookout ערכת ה-PCR לזיהוי.
Disclosures
הכותבים הם עובדי סיגמא אולדריץ שיצרה ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.
Acknowledgments
הממומן על ידי סיגמא אולדריץ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit | Sigma-Aldrich | MP0035 | |
| JumpStart Taq DNA Polymerase | Sigma-Aldrich | D9307 | |
| GenElute Blood Genomic DNA kit | Sigma-Aldrich | MP0030 | |
| Nunc amplification tubes | Sigma-Aldrich | T0447 |
References
- Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines. Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).
- Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT). Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).
- Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques. Molecular and Cellular Probes. , (2011).
