Geoptimaliseerde PCR-gebaseerde detectie van Mycoplasma

Summary

The Lookout Mycoplasma PCR Detection Kit maakt gebruik van de polymerase chain reaction (PCR), die gevestigd is als de methode van keuze voor de hoogste gevoeligheid in de detectie van Mycoplasma, Acholeplasma, en Ureaplasma besmetting in celkweken en andere celculturen afgeleid biologicals.

Abstract

Het onderhoud van de verontreiniging-vrije cellijnen is essentieel voor cel-onderzoek. Een van de grootste verontreiniging zorgen zijn mycoplasma besmetting. Hoewel mycoplasma meestal niet doden verontreinigd cellen, zijn ze moeilijk te detecteren en kan een verscheidenheid aan effecten op de gekweekte cellen, met inbegrip veranderde metabolisme veroorzaken, vertraagde proliferatie en chromosomale afwijkingen. In het kort, mycoplasma besmetting compromissen van de waarde van deze cellijnen in het verstrekken van accurate gegevens voor de life science onderzoek.

De bronnen van mycoplasma besmetting in het laboratorium zijn zeer uitdagend om volledige controle over. Aangezien bepaalde mycoplasma soorten zijn te vinden op de menselijke huid, kunnen ze worden ingevoerd door middel van een slechte aseptische techniek. Bovendien kunnen ze komen van verontreinigde supplementen zoals foetaal runderserum, en vooral van de andere besmette celculturen. Zodra mycoplasma een cultuur vervuilt, kan het zich snel verspreiden naar andere delen van het lab besmetten. Strikte naleving van goede laboratoriumpraktijken zoals een goed aseptische techniek zijn de belangrijkste, en routine testen op mycoplasma is zeer aan te bevelen voor een succesvolle controle van mycoplasma besmetting.

PCR-gebaseerde detectie van mycoplasma is uitgegroeid tot een zeer populaire methode voor routine-cellijn onderhoud. PCR-gebaseerde detectie methoden zijn zeer gevoelig en kunnen snel resultaten, die stelt onderzoekers in staat om snel te reageren te isoleren en te elimineren besmetting als het eenmaal is gedetecteerd in vergelijking met de tijd die nodig is met behulp van microbiologische technieken. The Lookout Mycoplasma PCR Detection Kit is zeer gevoelig, met een detectielimiet van slechts 2 genomen per il. Gebruik te maken van de zeer specifieke JumpStart Taq DNA-polymerase en een eigen primer design, zijn valse positieven sterk verminderd. De handige 8-buis-formaat, strips pre-gecoat met dNTP's, en de bijbehorende primers helpt bij het verhogen van de doorvoer naar de behoeften van klanten te voldoen met grotere collecties van cellijnen.

Gezien de extreme gevoeligheid van de kit, moet grote zorg worden genomen om onbedoelde verontreiniging van monsters en reagentia te voorkomen. De stap-voor-stap protocol tonen we belicht de voorzorgsmaatregelen en de praktijken die nodig zijn voor een betrouwbare mycoplasma detectie. We laten ook zien en bespreken typische resultaten en hun interpretatie. Ons doel is ervoor te zorgen voor het succes van de onderzoekers het gebruik van de LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Protocol

1. Mycoplasma detectie

1. Cel kweeksupernatanten kan direct worden getest of het monster kunnen gereedgemaakt voor gebruik op een later tijdstip. Ter voorbereiding voor later gebruik plaats 100 ul van de bovenstaande vloeistof in een steriele buis versterking en incubeer bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Zodra dit is afgerond kan het monster bewaard worden bij 2-8 ° C gedurende maximaal een week. Vlak voor het uitvoeren van de steekproef kort centrifuge (5 seconden) tot pellet elke cellulaire puin.
2. Ter voorbereiding van de monsters voor PCR, bepalen het totale volume van Jumpstart Taq DNA-polymerase / rehydratie buffer die nodig is voor de reacties. We zullen de voorbereiding van in totaal 5 reacties. Vijf reacties vereist 2.5μl van de Taq-en 114.5μl van rehydratatie buffer. Deze bevat een minimum van een eenheid van Taq per reactie en 22.5μl van rehydratatie buffer per monster reactie en negatieve controle plus 24.5μl van rehydratatie buffer voor de positieve controle. 1 eenheid van DNA-polymerase per reactie dient te worden toegevoegd aan het juiste volume van rehydratatie buffer. Dit zal variëren met de gebruikte Taq.
3. Plaats de berekende volume van Taq DNA-polymerase in een schone microcentrifugebuis en volg met de berekende volume van rehydratatie buffer. Het DNA polymerase / rehydratie buffer moet voorzichtig worden gemengd door flicking de buis. Dit mengsel mag niet worden gevortexed.
4. Ter voorbereiding op de negatieve controle en monsters gebruik maken van de transparante reactie buizen die in de kit. De reactie buizen die in de kit al bevatten de nuclueotides, primers en interne controle DNA. 23 ul van Jumpstart Taq DNA-polymerase / Rehydration buffer mix, zoals bereid in de vorige stappen, moeten worden geplaatst in elk van de negatieve controle en monsterbuizen. Voeg 2 pl DNA vrij water met de negatieve controle en voeg 2 pl van het monster aan elk van de steekproef buizen en label. Meng de inhoud door flicking de buizen. Inhoud mag niet worden gevortexed.
5. Ter voorbereiding op de positieve controle gebruik maken van de roze reactie buizen die in de kit. De reactie buizen die in de kit al bevatten de nuclueotides, primers en interne controle DNA. Voeg 25 ul van Jumpstart Taq DNA-polymerase / Rehydration buffer mix, zoals bereid in de vorige stappen, om de reactie te buizen en label. Meng de inhoud door flicking de buizen. Inhoud mag niet worden gevortexed. Incubeer de negatieve controle, positieve controle en monsterbuizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
6. Voor de PCR plaatsvinden de monsters moeten worden geplaatst in een thermische cycler. Bij het gebruik van JumpStart Taq een activatie stap is niet vereist. Plaats de reageerbuizen in de thermische cycler. De cycli moet worden ingesteld als volgt: 94 ° C gedurende 30 seconden, 55 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 40 seconden. Deze cycli zal worden uitgevoerd 40 keer.
7. Zodra de PCR-cycli hebben afgerond van de monsters moeten worden gekoeld tot 4-8 ° C door ze te verwijderen uit de thermal cycler en deze te plaatsen in het ijs. Wanneer de monsters zijn afgekoeld moeten ze worden geladen op de agarosegel voor elektroforese. Het laden van gel en kleurstof zijn niet nodig, aangezien ze al aanwezig zijn in de reactie buizen. Direct belasting 8 ul voor elke PCR in een aparte rijstrook. Stop de elektroforese na de migratie van 2,5 - 3,0 cm.

2. Representatieve resultaten

De negatieve controle moet blijken een band van ongeveer 481 bp. Dit kan worden gezien in de negatieve controle kolom op de elektroforese-gel die wordt weergegeven bij het begin van de video. De afwezigheid van de negatieve controle band op 481 bp is een goede indicator dat de activiteit van het polymerase niet was sufficienttaq gebruikt was niet gevoelig genoeg.

Mycoplasma positieve monsters zal bands in het bereik van 270 ± 8 bp. De band zal zwaar zijn voor sterk vervuilde monsters en zwak voor licht verontreinigde monsters. De variaties in intensiteit kan worden gezien in de positieve monster kolommen op de elektroforese-gel die wordt weergegeven bij het begin van de video. Alle monsters bevatten een interne negatieve controle aan te tonen dat de PCR zich zoals verwacht. Het is normaal om te zien de afwezigheid van de interne controle op sterk vervuilde monsters.

Als er niet een band in de positieve bereik of een band in de negatieve reeks van uw monster is dit een goede indicator dat uw monsters worden geremd. Als het monster remde de PCR-inhibitoren kan worden verwijderd door het uitvoeren van een DNA-extractie.

. Figuur 1 Relevante Amplicon bands: Resultaten voor het opsporen van mycoplasma door PCR worden weergegeven. Laan 2 is de negatieve controle, die een band moet blijken op ongeveer 481 bp. De afwezigheid van de negatieve controle band op 481 bp is een goede indicator dat de Taq gebruikte was niet gevoelig genoeg. Mycoplasma-positieve monsters zal bands in het bereik van 270 + 8 bp, zoals aangegeven in lanen 3 - 6. De band zal worden heavy voor sterk vervuilde monsters (baan 6) en zwak voor licht verontreinigde monsters (laan 4). Alle monsters bevatten een interne negatieve controle (481 bp) aan te tonen dat de PCR zich zoals verwacht. Het is normaal om te zien de afwezigheid van de interne controle op sterk vervuilde monsters.

Discussion

Vanwege de extreme gevoeligheid van de kit, indien correct uitgevoerd van de kit moet opleveren precieze resultaten waaruit blijkt of je steekproef mycoplasma besmetting heeft. De kit is geoptimaliseerd voor gebruik met JumpStart Taq DNA-polymerase. Andere taqs kunnen worden gebruikt bij de voorbereiding van de monsters, maar de interne controle band op 481 bp moet aanwezig zijn om de juiste gevoeligheid van de alternatieve Taq te geven. Het is mogelijk voor de positieve bands te exposeren verschillende dichtheden, afhankelijk van de mate van verontreiniging. Het is mogelijk om de afwezigheid van de interne controle band op zwaar verontreinigde monsters. Met behulp van voorzichtigheid en een goede techniek bij het bereiden van de monsters om besmetting te voorkomen zijn essentieel voor een goede. detectie bij gebruik van de LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit	Sigma-Aldrich	MP0035
JumpStart Taq DNA Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307
GenElute Blood Genomic DNA kit	Sigma-Aldrich	MP0030
Nunc amplification tubes	Sigma-Aldrich	T0447