Summary
살아있는 동물 이내에 줄기 세포 차별을 공부에 대한 매력적인 모델은 planarian의 flatworm입니다. 재생 쉽게 기본적인 실험실에서 수행하는 간단한 절단 실험에서 공부하고 약리 및 유전 (의무뿐입니다
Abstract
자유 생활 planarian의 flatworms 자신의 뛰어난 재생 능력을 1로 실험적인 사용 때문에 오랜 역사를 가지고. 이 동물에서 excised 작은 조각이 없거나 신체 구조의 재생 다음 원래 신체 계획을 개혁. '트렁크'조각이 손상 웜으로부터자를 경우 예를 들어, 새 '머리'anteriorly 재생되며, '꼬리'는 (그림 절단하기 전에 원래의 신체 구조의 '머리 - 투 - 꼬리'극성을 복원 뒤로 재생성합니다 1A).
재생 정상 신체 항상성 및 집행 조직 재생 중에 ~ 30 서로 다른 세포 유형으로 차별 'neoblasts'로 알려진 planarian 줄기 세포에 의해 구동됩니다. 이 재생 과정은 강력하고 입증하기 쉽습니다. 여러 선구 실험실, 다양한 도구와 기능 유전 방법의 헌신에 때문에 지금은이 모델을 시스템에 최적화된되었습니다. 따라서, 상당한 최근의 진전은 planarian 발달 소성 2-9을 underpinning 분자 이벤트를 이해하고 조작하였습니다.
planarian 모델 시스템은 과학자들의 광범위한 관심을 것입니다. neuroscientists 들어, 모델은 전체 신경계의 재생을 연구보다는 단순히 regrowth / 일반적으로 많이 설립 모델에 연구의 초점 아르 단일 신경 세포 프로세스의 복구합니다. 수있는 기회를 내실수 Planarians는 신경 전달 물질 10 과다을 표현 중추 신경계 11, 12의 진화를 연구를위한 중요한 시스템을 대표하고 행동 선별 가능성 13, 14 있습니다.
재생 결과는 약리 및 유전자 조작에 의해 apparoaches 의무가 있습니다. 예를 들어, 약물 단순히 몸과 조각을 배치 약물이 포함된 절단 후 다른 시간 지점에서 솔루션을하여 재생에 대한 효과에 대한 심사 수 있습니다. 개별 유전자의 역할은 microinjection의 사이클이나 dsRNA 구조 8, 9, 15 bacterially - 표현 이송을 통해 얻을 수있는 최저의 방법을 (생체내 RNAi)를 이용하여 공부하실 수 있습니다. 두 방식은 바이폴라 동물 16-21 높은 penetrance - 예를 들어, 재생시 시각적으로 눈에 띄는 phenotypes를 만들 수 있습니다. 이 모델과 같은 방법을 구현 채택을 촉진하기 위하여, 우리는 planarian의 Dugesia가 자포니카 사용 약리 및 유전 assays (생체내 RNAi의 먹이에 의해)이 동영상 기사 프로토콜의 쇼케이스.
Protocol
1. 트렁크의 조각 재생 분석
- 동물 폐기물 및 섭취 식품 (~ 30 그대로 웜, 각 벌레 ~ 포스트 기아 길이 80~10mm) 무료입니다 보장하기 위해 재생 분석하기 전에 최소한 5 일 동안 벌레의 일대 먹이를 중지합니다.
- 분석의 날, 물을 미리 냉동 파괴 얼음 접시를 씻어 및 플라스틱 포장으로 평면 아이스 표면을 커버. 포셉를 사용하여 플라스틱 랩에 하나의 필터 용지를 넣으십시오.
- 물이 몇 방울로 필터 종이를 축축하게하다. 전송 피펫을 사용하여 필터 (필터마다 <20 웜)에 planarians을 전송합니다. 웜 더 샘물과 repipetting하여 필요한 경우, 필터에 재배치 수 있습니다. 초과 액체를 제거합니다.
- 메스를 사용하여 동물의 앞쪽에 정점과 인두 (그림 1A)의 앞쪽에 끝 사이의 약 절반을 만든 싱글 컷으로 머리를 절단.
- 메스를 사용하여 약 절반 꼬리 동물의 종료와 인두 (그림 1A)의 후부 끝 사이에 만들어진 하나의 상처로 꼬리 지역을 절단. 절단 후 70 % 에탄올로 moistened 종이 타월을 사용하여 메스에 과도한 가래를 제거합니다. 메스에서 초과 에탄올을 닦아주십시오.
- 샘물이 들어있는 페트리 접시 (100 X 25mm 깊이)에 집게를 통해 필터를 전송합니다. (상처의 봉합, 상처의 곤란과 고난으로 관찰할 수) ~ 3 분 동안 기다리십시오.
- thermostatted 인큐베이터로 재생 분석 및 전송 (24 ° C)에 원하는 매체를 포함하는 페트리 접시에 여과지에서 간선 조각을 씻어.
- 재생 구조는 (그림 1A) 확인할 수있다 ~ 1 주일 만에 점수가 재생 표현형.
2. praziquantel에 의해 유도된 bipolarity : 중생의 약리 조작
- DMSO의 solubilizing 약물 (200mM 주식 1mL에 62.4mg PZQ)에 의해 praziquantel (PZQ) 재고를 준비합니다. 당일에 사용하십시오.
- 버퍼 Montjuch 소금에서 마약이 포함된 솔루션 (90 μm의 PZQ)의 50mL를 확인합니다. 분산을 위해 ~ 1 분 와동.
- [프로토콜 # 1] 최종 단계 [1.7]에서 PZQ에 트렁크 조각의 코호트를 노출, 위의 내용과 같은 트렁크 조각 재생 분석을 수행합니다.
- 24-48시간 후, 교환 PZQ 함유, 샘물에 대한 미디어 웜 여러 (> 3) 번 세척.
- 인큐베이터에 벌레를 반환합니다. 점수 bipolarity (2 헤드, 그림 1B) 절단 후 일주.
3. 중생의 유전자 조작 : 생체내 RNAi 먹이 프로토콜
- 이전 분석하기 위해 닭고기 간 homogenate를 준비합니다. foodstock에서 지방산, 노란색 컬러 섹션, 그리고 퓌레 나머지 간을 폐기하십시오. 저장 메쉬 스트레이너 및 나누어지는 서스펜션 (1.5mL 튜브, -20 ° C)를 통해 필터 퓌레.
- 이전 분석하기 위해, -20 ° C.에 저장된, 1mL 샘플로 공급을 aliquoting하여 소 적혈구 (RBCs)를 준비
- RNAi에 대한 웜을 선택합니다. 세 동료가 사용됩니다 : 관심의 유전자, 긍정적인 제어 (알려진 RNAi의 표현형과 유전자, 그림 1C, D & E)과 부정 제어 (NO RNAi의 표현형과 유전자, 실험 코호트에 비해 최저 수준의 평가에도 유용합니다.) 각 코호트 들어, ~ 250 벌레를 (최소한 5 일 굶어 후 긴 ~ 80~10mm)을 사용합니다. 플라스틱 욕조에 샘물에 보관하십시오.
- 관심 dsRNA 대상으로 유전자를 표현 E. 대장균의 각 RNAi의 보병대, 해동 재고에 대한 [8], 닭고기 간 homogenate의 튜브와 함께 [3.1]와 RBCs의 튜브 [3.2].
- 펠렛 박테리아 (1만3천그램 1 분). 2xYT 미디어 (~ 700μl)에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. 얼음 뜨는, 장소 펠렛을 삭제, Recentrifuge.
- 팁의 끝을 잘라하여 큰 구멍 P200 피펫 팁을 만듭니다. 철저히 RNAi 수유 믹스를 만들 수 닭고기 간 homogenate (150 μL)와 RBCs (50 μL)의 혼합물에있는 박테리아 펠렛을 resuspend. 원심 분리하여 기포를 제거합니다.
- 먹이를 들어, (~ 1 인치 깊이를 떠나) 벌레가 들어있는 플라스틱 욕조에서 물의 대부분을 제거합니다. 소용돌이 욕조는이 컨테이너의 중심에 벌레를 집중하고, 벌레를 corralling 원안에 피펫 RNAi의 먹이 혼합합니다. 신중하게 다른 식사를 perturbing 않고 RNAi의 먹이 혼합에 다시 escapees을 동축 케이블로 전송 피펫을 사용!
- 수유 후 (~ 1 시간), 잘 공급되는 planarians를 확인합니다. 이 벌레는 섭취 RBCs에서 딥 레드 착색을 보여줍니다. 다른 사람을 폐기하십시오.
- 신중하게, 신선한 샘물과 솔루션을 먹이 음식 egestion을 방지하기 위해 교란을 최소화 바꿉니다. 이렇게하려면 부드럽게 전송 피펫을 사용하여 튜브의 한쪽으로, 흐린 물을 부어하고, 조심스럽게 욕조의 반대편 벽을을 붓고 신선한 물로 교체 벌레를 집중. Resubmerge의 planarians 신속하게 공기에 장기간 노출로도 식품 egestion 결과.
- 대충 SE앨 컨테이너 뚜껑과 인큐베이터로 돌아갑니다 (24 ° C)
- 재생주기 [프로토콜 # 1] RNAi의 phenotypes에 대한 화면으로 함께 interspersed 여러 사이클을 통해 RNAi 먹이 프로토콜 (따로 ~ 2-3일)를 반복합니다. 많은 유전자에 대한 효과적인 이송 및 재생을위한 표준 프로토콜은 총 기간이 ~ 1 달 걸립니다 그림 2에 표시됩니다.
최적의 프로토콜과 같은 mRNA의 안정성, 조직 현지화, 단백질 perdurance, 또는 재생 후 여러 먹이주기 걸로 표현형의 개발과 같은 요인에 따라 달라집니다로, 다른 유전자에 대해이 제도를 수정합니다. 단순히 부정적인 제어 일대와 타겟 mRNA 수준을 비교하는 (명백한 경우) 표현형의 penetrance에 대한 심사 또는 qPCR의 방식에 의해 최저 수준을 평가합니다.
4. 대표 결과 :
트렁크 조각 재생 분석은 모든 벌레 정상 앞쪽에 - 후부 ( '꼬리에 머리') 극성을 재생성해야하는 등 강력합니다. 이것은 바로 앞쪽에 eyespots (asterixed, 그림 1A)의 출현에 의해 용이 절단 후 5 일,로 득점 수 있습니다. 그러나, 손실 구조의 완전한 형태학의 복원은 일주일 뒤에 발생합니다. 두 달린 벌레를 항복하는 PZQ하여 트렁크 조각 재생의 약리 조작 (그림 1B)가 또한 강력합니다 (EC 50 = 87 (+ -) 11 %의 바이폴라 조각 48 시간 20 70μM PZQ). Bipolarity 하나의 재생 사이클을 통해 발생합니다. 이러한 assays의 낮은 효율 가능성이 약물 용해도 및 / 또는 저장하거나, PZQ 안 먹힐 다른 flatworm 종의 사용 문제와 관련이 있습니다. 낮은 penetrance과 마약, anteriorization 지수는 종종 전체 bipolarity의 22 별도로 중간 phenotypes을 점수하는 데 사용됩니다. 긍정적인 제어 구조의 RNAi로 인한 Phenotypes는 그림 1에 표시됩니다 : 자포니카 Dugesia의 RNAi 여섯 1 (D J - 6 - 1) 눈이없는 표현형 23 일 (그림 1C), Dugesia 자포니카 PC2의 RNAi (DJ - PC2) 결과 빛이 싫다고 응답 24 (그림 1D)과 RNAi의 손실 결과 Dugesia 자포니카 βcatenin - 1 (DJ - βcatenin - 1) 트렁크 조각 (그림 1E)에서 두 개의 머리 표현형 16-19, 21을 초래합니다. 이러한 phenotypes은 다음 간단한 RNAi 프로토콜을 사용하여 얻을 수있다 : DJ - 6 - 1 (FFxFx), DJ - PC2 (FFFx), DJ - βcatenin - 1 (FFxFx) 어디 F = 먹이주기 및 X = 재생 사이클 각각.
그림 1 :... 트렁크 조각 재생 분석 왼쪽, excised 트렁크 조각의 위치를 표시 planarian (위)와 개략도 (중간)의 이미지를 마우스 오른쪽, 트렁크 조각 재생의 timecourse이 표시된 시간에 재생 조각의 모양 (일) 보여주 B PZQ 노출에 의해 제작. 쌍두 planarian 이미지 DJ - 6 - 1 RNAi. 모바일 컨트롤 벌레에 비해 고정되어 DJ - PC2 RNAi 웜 (스테인드 적색)의 빛을 혐오 반응의 D 손실 (스테인드에 의해 만들어진 C '눈이없는'벌레 녹색). E 바이폴라 planarian는 DJ - βcatenin - 1 RNAi에 의해 만들어진. BE에서 RNAi 벌레의 원래 앞쪽에 끝이 왼쪽으로 지향합니다.
그림 2 : D. 많은 유전자의 분해에 대한 효과가 여러 feedings로 구성된 전형적인 RNAi 프로토콜 (F) 및 재생 사이클 (X)에 대한주기를 먹이 및 절단의 순서 자포니카. 개별 유전자에 대해이 프로토콜의 변경은 사용하는 예를 들어, 최적의 결과를 얻을 필요가있을 수 있습니다 적은 (괄호) 또는 수유 및 재생 사이클의 큰 수입니다.
Discussion
프로토콜은 자포니카 planarian의 Dugesia의 재생을 연구하고 조작 여기 상세 assays을 설명했다. 그들은 간단하고 쉽게 실험실이나 교실에서 수행할 수있는 전문 장비가 이러한 요구하지 않습니다. Assays 개별적으로 수행하거나, 결합 (생체내에서 마약 efficacies의 화학 유전자 검사)와 후보 유전자 수준에서 수행할 수 있습니다, 또는 불편, 높은 처리량 검사 8 적응력이 아르 수 있습니다. 자신의 권리를 planarians의 흥미로운 생물학을 공부에 대한 여부, 또는 조직 재생을 연구에 대한 대안 모델의 포유 동물 homologues의 생체내 기능의 평가에 대한 이러한 접근 방식은 연구자의 다양한에서 관심을 catalyze해야합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
실험실에서 작업은 NSF (MCB0919933)와 NIH (GM088790)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Spring water | Kandiyohi. Premium Waters Inc. Minneapolis, MN | n/a | Other forms of spring water work well also. Trial first in viability assays. |
| 1 x buffered Montjuïch salts: NaCl (1.6mM), CaCl2 (1mM), MgSO4 (1mM), MgCl2 (0.1mM), KCl (0.1mM), NaHCO3 (1.2mM), HEPES (1.5mM). pH 7.4 at 24°C. | Multiple Suppliers | n/a | Artificial water for drug treatments during regenerative assays to ensure pH buffering. 5/8 Holtfreter’s solution is an alternative. |
| 2xYT Broth | Fisher Scientific | BP2467-500 | Media = 31 g/L . Autoclaved. |
| Petri Dish (100x25mm) | Fisher Scientific | 08-757-11 | Housing worms during regeneration cycles |
| Square Dish (100x100x15mm) | Fisher Scientific | 08-757-11A | Fill with water, freeze for ice tray used as worm cutting surface |
| Plastic tub: Ziploc Twist ’n Loc (16oz). | Various | n/a | Convenient water tight containers for RNAi cohorts |
| Chicken Liver | Commercial grocery | n/a | Bias towards organic supplies, owing to avoidance of antibiotics. |
| Hand Blender | Any Supplier | n/a | Use for making chicken liver puree |
| Wire 1mm Mesh strainer | Any Supplier | n/a | Use for straining chicken liver puree |
| Bovine red blood cells | Lampire Biological Laboratories | 7240807 | 100% Washed and pooled RBC suspension |
| Circular filter papers | Whatman, GE Healthcare | 1003 055 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-41 | |
| Sterile, surgical blades | Multiple Suppliers | n/a | |
| ±Praziquantel | Sigma-Aldrich | P4668 | Store powder aliquots in the dark at 4°C. Desiccate. |
| Dj-six-1 | GenBank AJ557022.1 | RNAi positive control for “eye-less” phenotype23 | |
| Dj-βcatenin-1 | GenBank AB181913.1 | RNAi positive control for two-headed phenotype17 | |
| Dj-PC2 | RNAi positive control for loss of light aversion phenotype24 |
References
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