Summary
Abstract
Hsp90 הוא חלבון חיוני ורב מאוד המלווה המולקולרי נמצא להסדיר יותר מ 150 חלבונים איתות אוקריוטים, כולל גורמי תעתוק (קולטנים גרעיני למשל, p53) ו קינאזות חלבון (למשל Src, רף, Akt קינאז) מעורב אופניים התא, tumorigenesis, אפופטוזיס, וכן מספר רב של מסלולים 1,2 אוקריוטים איתות. רבים מבין אלה חלבונים "לקוח" עבור Hsp90, ההרכבה של קולטן סטרואידים • Hsp90 מתחמי הוא הטוב ביותר מוגדר (איור 1). אנו מציגים כאן קולטן glucocorticoid להתאמה (GR) assay immunoprecipitation ו במבחנה GR • Hsp90 שיטה הכינון מחדש כי ניתן להשתמש בקלות לחקור פעילות אוקריוטים Hsp90 פונקציונלי, Hsp90 בתיווך ליגנד רצפטור סטרואידים מחייב, מולקולרית cofactor דרישות המלווה. לדוגמה, assay זה יכול לשמש כדי לבדוק את דרישות Hsp90 cofactor ואת ההשפעות של הוספת מרכיבים חיצוניים לתהליך הכינון מחדש.
GR כבר מערכת שימושית במיוחד ללימוד Hsp90 כי הקולטן חייב להיות מאוגד Hsp90 יש מחייב ליגנד פתוח שסוע הנגיש 3 סטרואידים. GR אנדוגני, unliganded נמצא בציטופלסמה של בתאי יונקים מחויב noncovalently כדי Hsp90. מצאו כמו GR אנדוגני • Hsp90 heterocomplex, ליגנד GR מחייב שסוע פתוח מסוגל סטרואידים מחייב. אם Hsp90 מנתק מ GR, או אם תפקידה הוא עכבות, הקולטן אינו מסוגל להיקשר סטרואידים דורש הכינון מחדש של GR • Hsp90 heterocomplex לפני פעילות מחייב סטרואידים משוחזר 4. GR ניתן immunoprecipitated מ cytosol התא באמצעות נוגדן חד שבטי, וחלבונים כגון Hsp90 ומורכבת כדי GR ניתן assayed ידי כתם המערבי. פעילות מחייב סטרואידים של GR immunoprecipitated ניתן לקבוע על ידי דוגרים immunopellet עם [3 ח] סטרואידים.
ניסויים קודמים הראו Hsp90 בתיווך הפתיחה של הכריכה GR ליגנד שסוע מחייב hsp70, המלווה המולקולרי second חיוני גם כדאיות התא האיקריוטים. פעילות ביוכימית של Hsp90 ו hsp70 הם catalyzed ידי הופ חלבונים שיתוף המלווה, hsp40, 5 ו - p23. המלווה multiprotein מכונות המכיל Hsp90, הופ hsp70, ו hsp40 הם endogenously הנוכחית בציטופלסמה תא אוקריוטים, ו lysate reticulocyte מספק המלווה עשירים מקור חלבון 6.
בשיטה הציג, GR הוא immunoadsorbed מ cytosol התא הפשיטו של מכונות המלווה אנדוגני hsp90/hsp70 באמצעות תנאים מלח קל. GR הפשיטו מלח הוא מודגרות אז עם lysate reticulocyte, ATP, ו-K +, שתוצאתה הכינון מחדש של GR • Hsp90 heterocomplex ו מחדש של פעילות מחייב סטרואידים 7. שיטה זו יכולה להיות מנוצל כדי לבדוק את ההשפעות של cofactors המלווה שונים, חלבונים רומן, וניסיוני מעכבי Hsp90 או GR כדי לקבוע משמעות תפקודית שלהם על Hsp90 בתיווך 8-11 מחייב סטרואידים.
Protocol
1. הכנת cytosol התא המכיל GR פונקציונלי
- הערה טכנית: חוצצי כל צריך להיות בקירור כל צעד של פרוטוקול זה, לרבות centrifugations ו הדגירה, צריכה להתבצע על הקרח או 4 ° C, אלא אם צוין אחרת. הטמפרטורה הנמוכה היא חיונית כדי למנוע השפלה של מתחמי GR וחלבונים.
- בעזרת צנטריפוגה בקירור, לקבל ~ 1-5 מ"ל גלולה של תאים מבטאת ריכוז גבוה של GR תפקודית. דוגמאות למקורות תא עשיר GR כוללים פיברובלסטים עכבר L929 תאים, המבטאים ריכוז גבוה של GR אנדוגני, ו Sf9 התאים נדבקו baculovirus רקומביננטי GR (למשל baculovirus p2Bac מונסיניור-12). כ 15-20 מ"ל של תאים ארוז מתקבל לליטר תרבות Sf9 תא baculovirus. תאים צריך להיות גדל באופן אקספוננציאלי לפני הקציר. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 5000 × g עבור 5 דקות.
- שטפו את תא גלולה שלוש פעמים עם 15 מ"ל של תמיסת בופר "הנקס מלוחים. בין שוטף, resuspend בעדינות את הכדור, ואחריו centrifuging ב 5000 × g עבור 5 דקות. בעקבות לשטוף האחרון, להסיר לחלוטין את supernatant.
- הכן 7.5 מ"ל של חיץ homogenization המכיל מאגר שולי (10 HEPES מ"מ, 1 mM EDTA, נתרן molybdate 20 מ"מ, ה-pH 7.4), 1 phenylmethylsulfonyl mM פלואוריד (PMSF), ו 3 טבליות הקרקע של מעכבי פרוטאז ה-Mini-השלם. PMSF ולהשלים-Mini טבליות proteolysis למנוע התרחשות במהלך השלבים הבאים. השלם את ה-Mini-טבליות ניתן הקרקע בקלות בסדר אבקה עם ובמכתש. הוסף 1.5 כרכים של חיץ homogenization על גלולה התא.
- שבר את התאים על ידי homogenization Dounce (50 משיכות) או הקפאה / הפשרה (3 מחזורים) טכניקה. Homogenization Dounce יכול לשמור GR אנדוגני משופר • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מהיר כדי להשלים. הקפאה / הפשרה חוקר מספק הזדמנות להשעות את פרוטוקול בשלב הזה ולהמשיך במועד מאוחר יותר. Homogenization Dounce יש לבצע עם homogenizer בדלי קרח כדי למנוע פירוק חלבונים. הקפאה / הפשרה ניתן להשיג על ידי הקפאת צינור צנטריפוגה המכילה את התא גלולה-homogenization תערובת חיץ עם חנקן נוזלי, קרח יבש, או -20 ° C הדגירה, ואחריו להפשרה אמבטיה 30 מעלות צלזיוס המים.
- הפרד את cytosol GR-המכילה חומר מן התא מקרע חלקיקי על ידי ultracentrifugation. מעבירים את homogenate לצינורות ultracentrifuge עמיד, צינורות האיזון על ידי המוני זוגות, ו צנטריפוגות ב 100.000 × גרם במשך 30 דקות.
- הסר את cytosol (supernatant) ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב 500 aliquots μl ב 1.5 microcentrifuge צינורות מ"ל עבור אחסון לטווח ארוך. כדי לשמר את מרבית פעילות GR פונקציונלי, פלאש להקפיא את aliquots בחנקן נוזלי או דגירה למשך 30 שניות בתוך אמבט קרח יבש, מתנול לפני האחסון. קח זהירות להימנע ממגע ישיר עם העור מגיב הקירור.
2. Immunoadsorption של GR מתא cytosol
- הערה טכנית: איור 2 מספק סקירה סכמטית של 2-5 שלבים של פרוטוקול זה.
- הכן תערובת המכילה immunoadsorption אימונוגלובולינים חד שבטיים G (IgG) נוגדנים נגד העלה GR כדי immunoadsorb הקולטן מוכן בשלב 1. בתוך צינור 1.5 microcentrifuge מ"ל, המשלבים 100 μl של מופשר GR-המכיל cytosol, 200 חיץ TEGM μl (8 TES מ"מ, 4 מ"מ EDTA, 50 mM NaCl, molybdate 20 מ"מ, 10% (v / v) גליצרול, pH 7.6) , 100 μl של חלבון 20% A-Sepharose (PAS) slurry (v / v, שהוכנו חיץ TEGM), ו - 5 מיקרוגרם של נוגדנים נגד GR IgG חד שבטיים (למשל BuGR2). Molybdate נכלל למאגר TEGM כדי לעזור לייצב את GR-Hsp90 heterocomplex, אשר עשוי להיות שימושי כדי פעילות אנדוגני heterocomplex assay מחייב סטרואידים 13.
- Anti-GR נוגדן זמין מסחרית כמו מטוהרים חלבון. לחילופין, ניתן לקבל על ידי הוספת 10 μl של אנטי GR IgG המכילים מיימת לתערובת immunoadsorption. מיימת מופק על ידי עכברים שהוזרק עם אנטי GR תאים hybridoma (למשל FiGR hybridoma תאים 14), וריכוז נוגדנים המקורב המתקבל מיימת בשימוש בניסויים אלה היה 0.5 מיקרוגרם / μl, כפי שנמדד על ידי assay ברדפורד.
- הכן מדגם שליטה שלילי באמצעות GR-המכיל cytosol, חיץ TEGM ו PAS (כמתואר לעיל), וכן 5 מיקרוגרם של IgG כי אינו מכיר GR, Hsp90, או חלבונים אחרים המלווה המולקולרי (המכונה "nonimmune" נוגדנים).
- בשל גודל גדול יחסית חרוז PAS, להשתמש לחתוך P-200 טיפ pipet בעת העברת PAS משיירי 20% דוגמיות. Pipet טיפים גזור מוכנים על ידי חיתוך 2-3 מ"מ את הסוף של P-200 טיפים זמינים מסחרית, ובכך להגדיל את הצמצם קצה pipet.
- המקום דגימות לדגור על גלגל מסתובב אנכי מינימום של 2 שעות עם רוטציה קבועה. דוגמאות עשוילהיות מודגרות עד 8 שעות ללא הפסד של פעילות.
- בסיום הדגירה immunoadsorption, להסיר חלבונים מאוגד מן גלולה את הנוגדן-PAS ("immunopellet") על ידי צנטריפוגה. הפרד את supernatants מ immunopellets ידי צנטריפוגה בעזרת צנטריפוגה בקירור מתוכנת דקה 1 ב 10,000 × גרם, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם חיץ מ"ל 1 TEGM ו מערבולת. בעקבות צנטריפוגה בין שוטף, לבטל את supernatant להיות זהיר לא להפריע גלולה.
- הסר את כל supernatant בסיום לשטוף את השני. על מנת להבטיח שאף אחד גלולה הוא aspirated בשוגג, השתמש crimped P-200 טיפ pipet עבור supernatant השאיפה הסופית. טיפים pipet Crimped מוכנים על ידי השטחת זמינים מסחרית P-200 טיפים באמצעות מלקחיים.
3. דיסוציאציה של Hsp90 אנדוגני מן GR immunopellet ("מלח הפשטת")
- כדי immunopellet שטף מוכן בשלב 2, להוסיף 355 μl TEG חיץ (חיץ TEGM ללא molybdate נתרן) ו 45 μl של 5 M NaCl (סופי ריכוז NaCl 0.5 = M).
- המקום דגימות לדגור על גלגל מסתובב אנכי עבור 1.5 שעות עם רוטציה קבועה. דוגמאות ניתן מודגרות עד 2 שעות, אולם incubations יותר עשוי להוביל להתאוששות חלבון ולירידה ברמת הפעילות תפקודית נמוכה יותר.
- הסרת חלבונים מאוגד מן immunopellet על ידי צנטריפוגה. ספין דגימות דקה 1 ב 10,000 × ז שטפי פעם עם חיץ 1 TEG מ"ל ופעם עם 1 מ"ל של חיץ 10 mM HEPES, pH 7.4.
- הסר את כל supernatant בסיום לשטוף את השני, נזהר לא להפריע immunopellet, באמצעות P-200 crimped קצה pipet.
4. הכינון של GR • Hsp90 heterocomplex באמצעות מלווים מולקולרית, cofactors, ואת ה-ATP
- הערה טכנית: מספר עצום של תנאי הניסוי ניתן לבדוק על ידי כולל חלבונים נוספים, cofactors, activators, או מעכבי עניין לתוך התערובת מוכנה הכינון מחדש בהמשך. נפח כולל של תערובות הכינון מחדש צריך להיות <120 μl.
- לכל אחד מלח הפשיטו immunopellet מוכן בשלב 3, מוסיפים תערובת המכילה 50 μl הכינון מחדש של מקור המלווה מולקולרית 5 μl של מערכת ה-ATP מניבות (10 HEPES מ"מ, 50 מ"מ-ATP, קריאטין פוספט 250 מ"מ, 20 מגנזיום אצטט mM , 100 U / ml phosphokinase קריאטין, pH 7.4).
- תגובות הכינון יכול להיות מוגברת על ידי להשלים את תערובת הכינון מחדש עם 50 μl HKD חיץ (10 HEPES מ"מ, 100 מ"מ KCl, 5 מ"מ dithiothreitol (DTT), pH 7.4) ו - 5 μl נוסף של מערכת ה-ATP מניבות. צעד זה עשוי להיות מושמט אם הכינון מחדש נרחב ומחייבת סטרואידים הם נצפו. KCl מגביר פעילות ATPase hsp70 ו DTT מגן ציסטאין המכילים חלבונים מפני התחמצנות 9.
- מקור מומלץ המלווה המולקולרי זמין מסחרית reticulocyte lysate ארנב. מלווים מולקולרית הפרט מטוהרים מן lysate reticulocyte או הביע recombinantly (למשל 15 מיקרוגרם Hsp90, 15 מיקרוגרם hsp70, 0.6 מיקרוגרם הופ, 6 מיקרוגרם p23, ו - 0.125 מיקרוגרם hsp40 ב HKD החיץ) עשוי לשמש גם.
- דגירה דגימות אמבטיה 30 מעלות צלזיוס מים בדיוק 20 דקות. צינורות פליק כל 1-2 דקות על מנת בעדינות להפריע גלולה ומערבבים הפתרון הכינון מחדש.
- הוסף 1 מ"ל TEGM חיץ, מערבולת, ו 10,000 צנטריפוגות ב × גרם לדקה 1. הסר supernatant וזורקים נזהר לא להפריע גלולה. חזור עבור סכום כולל של שלושה שוטף. להסיר לחלוטין את כל supernatant בסיום לשטוף הסופי באמצעות crimped P-200 טיפ pipet.
5. ניתוח של קומפלקסים חלבונים מחדש ופעילות ליגנד מחייב
- חלבונים ב immunopellet מחדש ניתן לזהות על ידי קונבנציונאלי אלקטרופורזה denaturing polyacrylamide ג'ל (SDS-PAGE), אלקטרופורזה microfluidic (למשל Bio-Rad Experion), ו סופג המערבי (איור 3). הערה טכנית: פרוטוקולים מעולה המתאר SDS-PAGE 15 ו המערבי סופג 16 זמינים כעת, באדיבותו של חוקרים אחרים.
- הוסף 50 μl של חיץ SDS-PAGE מדגם המכיל β-mercaptoethanol ו מערבולת. מאגר מתכונים ספציפיים מדגם להשתנות. בחר אחת על פי המלצת היצרן של מערכת אלקטרופורזה להיות מועסק.
- דגירה במשך 5 דקות באמבט מים רותחים 100 ° C או לחסום חום אלקטרוניים.
- צנטריפוגה ב 10,000 × גרם לדקה 1. הנוגדן immunoadsorbing, GR, וחלבונים ומורכבת כדי GR יהיו מנותקים אחד מהשני ומשוחרר supernatant החיץ המדגם.
- מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge טריים באמצעות קצה קצה crimped P-200 pipet. מחק את הכדור. המדגם הוא מוכן עכשיו לניתוח באמצעות זמינים מסחרית SDS-PAGE או מערכות אלקטרופורזה microfluidic. השלם או טכניקה following הוראות היצרן.
- ניתוח המערב כתם הבאים SDS-PAGE מאפשרת זיהוי מוחלט של GR immunoadsorbed ו מלווים מולקולרית ומורכבת כדי GR הבאה הדגירה הכינון מחדש. נוגדנים חד שבטיים שימוש ראשוני העלה נגד GR (BuGR2), Hsp90 (AC88), hsp70 (N27F3-4) ושיתוף המלווה חלבונים לזהות את המרכיבים העיקריים של GR • Hsp90 מורכב חלבון.
- הפעלה פונקציונלית של GR מלח הפשיטו הבאה הכינון מחדש של GR • Hsp90 מורכב החלבון ניתן לזהות על ידי assaying פעילות מחייב שימוש בסטרואידים [3 ח] סטרואידים (איור 4). במשך שארית של הפרוטוקול, בצע את אמצעי הזהירות הנדרשים עבור בבטחה טיפול דגימות tritiated ופסולת.
- כדי immunopellet מחדש, להוסיף למאגר שולי μl 47.5 ו 2.5 μl של 2 מיקרומטר [3 ח] dexamethasone (סטרואידים בריכוז סופי = 100 ננומטר).
- בעדינות מערבבים את גלולה נזהר כדי למזער את כמות מדגם העקורים לקיר של הצינור microcentrifuge.
- דגירה לילה על קרח. אין צורך לסובב או לערבב את דוגמיות במהלך הדגירה זה.
- הוסף 1 מ"ל חיץ TEGM, בעדינות לערבב 10,000 צנטריפוגות ב × גרם לדקה 1. בטל supernatant, להיות מודע שהוא מכיל מאוגד [3 ח] סטרואידים. חזור על סך של 3 שוטף עם חיץ TEGM.
- להסיר לחלוטין את כל supernatant בסיום לשטוף הסופי באמצעות crimped P-200 טיפ pipet. גלולה מכילה GR, מלווים מולקולרית Hsp90 אחרים ומורכבת כדי GR, ואת [3 ח] סטרואידים מחויב במיוחד לקולטן. מחייב ספציפי יכול להיות מחושב על ידי כולל dexamethasone 1000 פי שאינם tritiated עודף תערובת הדגירה לילה. כמו שליטה שלילי לסירוגין, את הנוגדן אנטי GR immunoadsorbing הוסיף 2.2 שלב עשוי להיות מוחלף עם אי - GR-immunoadsorbing נוגדן (NI).
- להשעות את immunopellets שטף במאגר 200 TEGM μl ולהעביר 10 scintillation צלוחיות מ"ל באמצעות חתך P-200 טיפ pipet.
- הוסף 4.8 מ"ל scintillation קוקטייל על צלוחיות מערבולת.
- כמות [3 ח] מחייב סטרואידים GR מחדש • Hsp90 מורכב החלבון ניתן assayed באמצעות ספקטרומטריית הנצנץ הנוזלי.
6. נציג תוצאות:
נציג SDS-PAGE ונתונים כתם המערבי מוצגים באיור 3. GR אנדוגני • Hsp90 heterocomplex הוא immunoadsorbed מ cytosol התא באמצעות אנטי GR נוגדנים וחלבונים הפרט כי שיתוף immunoadsorb עם GR הם דמיינו ידי מכתים Coomassie (איור 3A). אישור זהות החלבון של רכיב כלשהו של immunopellet בשלב כלשהו assay הכינון מחדש יכול להתבצע על ידי חישוב SDS-PAGE משקל מולקולרי סופג המערבי באמצעות נוגדנים חד שבטיים העלה נגד החלבון של עניין.
GR מחדש • Hsp90 heterocomplexes מוצגים באמצעות Experion נתונים microfluidic אלקטרופורזה (איור 3C ו 3D) ניתוח כתם המערבי (איור 3B). הספציפיות של immunoadsorption GR תאושר על ידי החלפת immunoadsorbing אנטי GR נוגדן עם נוגדן nonimmune (איור 3C, NI נתיבים IgG). גם כאשר כמויות עודפות של נוגדן nonimmune משמשים, מלווים לא GR או המולקולרית הם immunoprecipitated (ראה באיור. 3C, GR, Hsp90, להקות חלבון hsp70 נוכח נתיבי אנטי GR immunoadsorption עם חוסר של הלהקה שנצפו NI IgG נתיבים). כמו כן, ניתן לאשר את הניתוק של Hsp90 וחלבונים המלווה אחרים GR מלח הפשיטו על ידי ניתוח כתם המערבי (איור 3B) של immunopellets הפשיטו מחדש. השרשרת הכבדה של הנוגדן immunoadsorbing (HC) ניתן לזהות על ידי שני Coomassie הכתם המערבי סופג, וזה משמש כדי לאשר immunopellets בגודל שווה נמצאים דמיינו בנתיב אחד.
פעילות מחייב סטרואידים של GR immunoadsorbed ניתן assayed ידי עבור כל התנאים שנבדקו, ונציג נתונים מחייב סטרואידים מוצגים באיור 4. GR אנדוגני • Hsp90 heterocomplexes הם immunoadsorbed, מלח הפשיטו, ואת מחדש. שימוש או lysate reticulocyte או מטוהרים חלבונים, פעילות מחייב סטרואידים של GR מחדש • Hsp90 heterocomplex בדרך כלל חוזר 75-100% של GR אנדוגני • Hsp90 רמת הפעילות מחייב. בדומה לנתונים אלקטרופורזה, נוגדן nonimmune (NI) ניתן להשתמש במקום הנוגדן אנטי GR (אני) על מנת לשמש מלאה שלילי כמדד ספציפי [3 ח] מחייב סטרואידים.
באיור 1. דגם GR הרכבה Hsp90 • heterocomplex וג.ר. סטרואידים פתיחת שסוע מחייב. המנגנון המלווה hsp90/hsp70-based ממיר את ליגנד GR תחום מחייב מ folקונפורמציה ded שבה מחייב סטרואידים שסוע סגור ולא נגיש ההורמון קונפורמציה שסוע פתוח שניתן לגשת אליו (מאויר על ידי סמל heterocyclic סטרואידים). מכונות המלווה הוא preassembled בתא באופן ספונטני בצורה כאשר מטוהרים Hsp90, hsp70, ו הופ מעורבים בפתרון (Reaction 1). הופ tetratricopeptide מכיל 34 חומצות אמינו לחזור (TPR) מושלם (כפי שמודגם סהר כהה), והוא הוחלף מאוחר יותר על ידי תחום המכיל חלבון TPR immunophilin במהלך תהליך ההבשלה heterocomplex. מכונות פותח את הכריכה סטרואידים שסוע בצורה + תלויי ATP, ו-K, לאחר הופ ורוב בסופו של דבר hsp70 ו hsp40 לעזוב את מורכבות (מאויר כסמל מקווקו). באופן מכני, hsp70 אינטראקציה עם GR לפני Hsp90 ראשוניים הקולטן עבור Hsp90 ופתיחת שסוע הבאים. ניסיוני, מחייב סטרואידים ופתיחת GR שסוע גדל אם Hsp90 ו hsp70 נוכחים בעת ובעונה אחת. Heterocomplex הוא התייצב על ידי כניסה של p23 שיתוף המלווה Hsp90, אשר שומרת Hsp90 ב קונפורמציה ATP הנכנס. לאחר היציאה של הופ, משקל מולקולרי גבוה immunophilin (IMM) יכול להיקשר Hsp90, להרכיב את heterocomplex הסופי כפי שהוא התאושש מן התאים. מעובד מתוך פראט Toft 1.
איור 2. ייצוג סכמטי של שלבים 2-5 של פרוטוקול זה. GR היא immunoadsorbed מ cytosol התא באמצעות נוגדן חד שבטי הרים נגד GR (FiGR) חייב גלולה של חלבון A-Sepharose. Hsp90 וחלבונים אחרים המלווה הנוכחי GR אנדוגני • Hsp90 heterocomplex הם שיתוף immunoadsorbed עם GR, ואת GR הוא מסוגל להיקשר סטרואידים. Hsp90 הוא ניתק מן GR באמצעות טיפול מלח עדין, המכונה מלח הפשטת (רח'). הכריכה של סטרואידים שסוע GR-מלח הפשיטו נסגר, מה שהופך אותו מסוגל להיקשר סטרואידים. ביניים GR • Hsp90 heterocomplexes המכיל hsp70, hsp40, ו הופ, המסוגלים סטרואידים מחייב, יכול להיות מחדש (Recon) על ידי דוגרים מלח הפשיטו GR עם חלבונים מטוהרים או lysate reticulocyte (Retic lysate) ו cofactors. הפעילות מחייב סטרואידים ותוכן immunopellet חלבון של כל שלב ניתן לזהות על ידי לילה [3 ח] הדגירה סטרואידים סופג המערבי, בהתאמה.
איור 3. ניתוח חלבון Electrophoretic של קומפלקסים immunoadsorbed. , SDS-PAGE של GR מחדש • Hsp90 heterocomplex הדמיה באמצעות מערכת אלקטרופורזה קונבנציונאלי ואחריו electrotransfer והכתים Coomassie. בנוסף GR, Hsp90 ו hsp70, שרשרת כבדה (HC) שרשרת אור (LC) של נוגדנים הם דמיינו. הגירה של סמנים משקל מולקולרי (ביטוי KDA) מסומנים בצד שמאל. B, כתם המערבי של immunopellets המכיל מלח הפשיטו GR (רח') ו GR מחדש • Hsp90 heterocomplex (Recon). C, ג'ל וירטואלי של GR מחדש • Hsp90 heterocomplex שנוצר באמצעות מערכת microfluidic Experion אלקטרופורזה. שני ריכוזים שונים של nonimmune (NI IgG) ו החיסונית (אנטי GR) immunoadsorbing נוגדנים כלולים. IgGs NI לשמש שולטת שלילית. D, electropherogram של GR מחדש • Hsp90 heterocomplex מתקבלים ממדגם microfluidic אלקטרופורזה Experion הראו בנתיב השלישי של יתרונות פאנל של אלקטרופורזה ב microfluidic כוללים את הדרישה כרכים מדגם קטן יותר, ירידה טיפול הנוזל ופוסט לרוץ ניקוי, כימות משופרת באופן משמעותי מדגם קצר פועל.
איור 4. פעילות מחייב סטרואידים של immunopellets הבאים immunoadsorption של GR אנדוגני (Enodg), מלח הפשיטו GR (רח'), ו מחדש GR • Hsp90 heterocomplex (Recon). בנוסף immunoadsorbing GR עם נוגדנים חד שבטיים אנטי GR immunoadsorbing (אני), דגימות בקרה שלילית עבור כל תנאי הוכנו באמצעות אימונוגלובולינים nonimmune (NI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Assay שתוארו לעיל ניתן להתאים מבחן מספר עצום של מצבים המשפיעים על פעולות המלווה של המנגנון המלווה hsp90/hsp70-based וכן מחייב GR סטרואידים. זהו שינוי של שיטות 4,8,9,17 שדווח קודם לכן, והוא נועד לנצל את ההתקדמות בטכנולוגיה אלקטרופורזה ולהיות נגיש לקהילה מחקר רחב יותר. Cofactors נוספים או חלבונים עניין ניתן להוסיף GR • Hsp90 הכינון מחדש heterocomplex תערובת, המתואר שלב 4 של הפרוטוקול, על מנת לבחון השפעות על סטרואידים מחייב, חלבונים אינטראקציות heterocomplex, ושיתוף גורם הדרישות. למשל, האפקטים של reperfusion-איסכמיה על תפקוד Hsp90 ניתן הדגם עם תוספת של ריכוזי הגוברת של מינים חמצן תגובתי. חלבונים מטוהרים עם תכונה ספציפית (Hsp90 acetylated למשל) או פוטנציאל Hsp90 מעכבי (למשל geldanamycin אנלוגים רומן) ניתן להוסיף על מנת השפעתם על היווצרות מחייב heterocomplex סטרואידים שייקבע.
למטה זרם מבחני שונה מאשר אלקטרופורזה, מבחני מחייב המערבי סופג, ו סטרואידים עשויים גם להיות מועסק. לדוגמה, מתחמי multiprotein immunoprecipitated כבר נותחו על ידי cytometry זרימה עם הצלחה משמעותית 18,19. GR immunoadsorbed • Hsp90 מתחמי יכול להיות גם assayed למדינה נוקלאוטיד hsp90/hsp70 או דמיינו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי 17. Hsp90 חלבונים לקוח אחר מאשר GR עשוי לשמש (למשל להשגיח קינאז מחסום אני (Chk1) 20), מחקר הזרע בוצע באמצעות וריאציות של פרוטוקול זה עם קולטן אסטרוגן, קולטני פרוגסטרון, 1,13,21 ו - Src.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
בחר ריאגנטים אלקטרופורזה וניתוח תוכנה תמונה סופקו על ידי Bio-Rad.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק GM086822, מקווה לב מכון פרס יסוד מדעי, ואת מרדוק MJ מחקר הצדקה אמון מכללת התוכנית למדע. בחר ריאגנטים אלקטרופורזה וניתוח תוכנה תמונה סופקו בנדיבות על ידי Bio-Rad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. estern Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
