Summary
Protocol
1. Подготовка цитозоле клеток, содержащих функциональные GR
- Техническое примечание: Все буферы должны храниться в холодильнике, и каждый шаг этого протокола, в том числе центрифугирования и инкубации, должны быть выполнены на льду или при температуре 4 ° С, если не указано иное. Низкой температуры имеет важное значение для предотвращения деградации GR и белковых комплексов.
- Использование центрифуга с охлаждением, получать ~ 1-5 мл гранулы клеток, из которых выражает высокую концентрацию функциональных GR. Примеры клеточных источников богата GR включают мыши фибробластов L929 клеток, которые выражают высокую концентрацию эндогенных GR и Sf9 клетки, которые были инфицированы рекомбинантным GR бакуловирус (например p2Bac-MGR бакуловирус 12). Примерно 15-20 мл упакованных клеток получается один литр Sf9 культуре клеток бакуловирус. Клетки должны быть растет в геометрической прогрессии до уборки урожая. Центрифуга клеточной суспензии при 5000 х г в течение 5 мин.
- Промыть осадок клеток в три раза с 15 мл буферного солевого раствора Хэнкса. Между моет, мягко ресуспендирования гранул, а затем путем центрифугирования при 5000 х г в течение 5 мин. После последней стирки, полностью удалить надосадочную жидкость.
- Подготовка 7,5 мл буфера, содержащего гомогенизации HEM буфера (10 мМ HEPES, 1 мМ EDTA, 20 мМ молибдата натрия, рН 7,4), 1 мМ phenylmethylsulfonyl фторида (PMSF) и 3 земле таблетки Complete-Мини ингибитор протеазы. PMSF и Complete-мини таблетки предотвращения протеолиза от происходить в течение последующих шагов. Полное-Mini таблетки могут быть легко землю в мелкий порошок с помощью ступки и пестика. Добавить 1,5 объемами буфера для гомогенизации осадок клеток.
- Разрыв клеток Dounce гомогенизации (50 ударов) или замораживания / оттаивания (3 цикла) технику. Dounce гомогенизации может поддерживать улучшение эндогенного GR • Hsp90 белковых комплексов и быстрее, чтобы закончить. Замораживания / оттаивания предоставляет исследователю возможность приостановить протокола на этот шаг и продолжить на более позднее время. Dounce гомогенизации должна быть выполнена с гомогенизатор в ведерке со льдом, чтобы предотвратить деградацию белка. Замораживания / оттаивания может быть достигнуто путем замораживания центрифуге трубки, содержащей осадок клеток-гомогенизации буферной смеси с жидким азотом, сухим льдом, или -20 ° С инкубационный, после оттаивания в 30 ° С водяной бане.
- Отдельные GR-содержащих цитозоле от разрыва твердых частиц ячейки ультрацентрифугирования. Передача гомогената к долгосрочным труб ультрацентрифуге, баланс труб по массе в парах, и центрифуге при 100000 х г в течение 30 минут.
- Удалить цитозоле (супернатант) и хранят при температуре -20 ° C в 500 мкл аликвоты в 1,5 мл микроцентрифужных трубы для длительного хранения. Чтобы сохранить максимальную функциональную активность GR, флэш-заморозить порциями в жидком азоте или инкубировать 30 секунд в метанол-сухой ледяной бане перед хранением. Будьте осторожны, чтобы избежать прямого контакта кожи с охлаждением реагента.
2. Иммуноадсорбции ОТО от цитозоле клетки
- Техническое примечание: На рисунке 2 представлен схематический обзор Шаги 2-5 настоящего протокола.
- Подготовка смеси иммуноадсорбции содержащие моноклональные иммуноглобулина G (IgG) антитела, выдвинутых против г до immunoadsorb рецепторов подготовлен в шаге 1. В 1,5 трубки микроцентрифужных мл, смешайте 100 мкл талой GR-содержащих цитозоле, 200 мкл буфера TEGM (8 мм ТЭС, 4 мМ EDTA, 50 мМ NaCl, 20 мМ молибдата, 10% (объем / объем) глицерин, рН 7,6) , 100 мкл 20% белков-сефарозой (PAS) шлам (об. /, подготовленная в буфер TEGM) и 5 мкг анти-GR моноклональных антител IgG (например, BuGR2). Молибдата входит в TEGM буфером для того, чтобы помочь стабилизировать GR-Hsp90 heterocomplex, которая может быть полезна для анализа эндогенных стероидных heterocomplex связывающей активности 13.
- Анти-GR антител является коммерчески доступным как очищенный белок. Кроме того, он может быть получен путем добавления 10 мкл анти-GR IgG-содержащих асцит к смеси иммуноадсорбции. Асцит производится мышам вводили анти-GR гибридомных клеток (например, FiGR клетки гибридомы 14), а также приблизительную концентрацию антител, полученных из асцита и используемые в этих экспериментах составляла 0,5 мкг / мкл, измеренная с помощью анализа Брэдфорда.
- Подготовка отрицательный пример управления с использованием GR-содержащих цитозоле, TEGM буфер, и PAS (как описано выше), и 5 мкг IgG, которая не признает Г.Р., Hsp90, или другие белки шаперонов (именуемые "неиммунной" антитела).
- Из-за относительно большой размер PAS бисером, использование сократить P-200 наконечник пипетки при передаче PAS от 20% суспензии для пробирок с образцами. Советы Cut пипетки готовы, нарезая 2-3 мм от конца коммерчески доступных P-200 советов, тем самым увеличивая отверстие пипетки чаевые.
- Место образцов на вертикальных вращающихся колес и инкубировать в течение минимум 2-х часов при постоянном вращении. Образцы могутинкубируют в течение 8 часов без потери активности.
- По окончании инкубационного иммуноадсорбции, удаления несвязанных белков антителами PAS гранул ("immunopellet") с помощью центрифугирования. Отдельные супернатантах от immunopellets центрифугированием использованием охлажденного центрифуги запрограммирована в течение 1 минуты при 10000 × г, а затем промыть в два раза с 1 мл буфера TEGM и вихря. После центрифугирования, а также между мойками, отказаться от надосадочной быть осторожным, чтобы не беспокоить гранул.
- Удалите все супернатант при заключении второго стирки. Для того чтобы обеспечить ни один из гранул по неосторожности атмосферный, использование гофрированной P-200 наконечник пипетки для окончательного супернатант аспирации. Гофрированные советы пипетки готовятся уплощение коммерчески доступных P-200 советов использованием щипцов.
3. Диссоциация эндогенного Hsp90 из GR immunopellet ("Salt зачистки")
- Чтобы мыть immunopellet подготовлен в шаге 2, добавить 355 мкл буфера ТЭГ (TEGM буфера без натрия молибдата) и 45 мкл 5 М NaCl (конечная концентрация NaCl = 0,5 М).
- Место образцов на вертикальных вращающихся колес и инкубировать в течение 1,5 часа при постоянном вращении. Образцы могут быть инкубировали в течение до 2 часов, однако, больше инкубации может привести к снижению восстановления белков и нижней функциональной активности.
- Удаление несвязанных белков из immunopellet центрифугированием. Спиновые образцы в течение 1 минуты при 10000 × g. Вымойте раз с 1 мл TEG буфера и один раз с 1 мл 10 мМ HEPES буфере, рН 7,4.
- Удалите все супернатант при заключении второго мыть, стараясь не мешать immunopellet, с помощью гофрированной P-200 пипетки чаевые.
4. Восстановление ОТО • Hsp90 heterocomplex помощью молекулярных шаперонов, кофакторов и АТФ
- Техническое примечание: множество экспериментальных условиях может быть проверена путем включения дополнительных белков, кофакторов, активаторы или ингибиторы интерес в восстановлении смеси, приготовленной ниже. Общий объем разведения смеси должна быть <120 мкл.
- Для каждой соли лишил immunopellet подготовлен в шаге 3, добавьте восстановления смеси, содержащей 50 мкл источника молекулярного шаперона и 5 мкл АТФ-порождающая система (10 мМ HEPES, 50 мМ АТФ, 250 мМ креатинфосфата, 20 мМ ацетат магния , 100 ед / мл креатинфосфокиназы, рН 7,4).
- Восстановление реакции может быть увеличена путем дополнения восстановления смеси с 50 мкл HKD буфера (10 мМ HEPES, 100 мМ KCl, 5 мМ дитиотреитол (DTT), рН 7,4), и дополнительные 5 мкл АТФ генерирующей системы. Этот шаг может быть опущен, если достаточное восстановлению и стероидных обязательными не наблюдается. KCl увеличивает hsp70 активность АТФ-азы и DTT защищает цистеин-содержащие белки от окисления 9.
- Рекомендуется источника молекулярного шаперона является коммерчески доступным лизата ретикулоцитов кролика. Индивидуальные молекулярных шаперонов очищенный от ретикулоцитов лизата или рекомбинантно выражена (например, 15 мкг Hsp90, 15 мкг hsp70, 0,6 мкг-хоп, 6 мкг p23, и 0,125 мкг hsp40 в HKD буфера), также могут быть использованы.
- Инкубируйте образцы в 30 ° С на водяной бане ровно 20 минут. Флик трубы через каждые 1-2 минут, чтобы мягко беспокоить гранул и смешать восстановления решения.
- Добавить 1 мл TEGM буфера, вихрь, и центрифуге при 10000 х г в течение 1 минуты. Удалить супернатант и отказаться тем, чтобы не мешать гранул. Повторите эти действия для всего три стирок. Полностью удалите супернатант при заключении окончательного смойте гофрированные P-200 пипетки чаевые.
5. Анализ восстановленные комплексы белков и лигандов деятельности
- Белки в восстановленной immunopellet можно определить по обычным денатурирующих электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE), микрожидкостных электрофореза (например, Bio-Rad Experion), и западной промокательной (рис. 3). Техническое примечание: Отлично протоколов описания SDS-PAGE 15 и западной промокательной 16 в настоящее время доступны, любезно другими исследователями.
- Добавить 50 мкл SDS-PAGE образец буфера, содержащего β-меркаптоэтанола и вихря. Конкретные рецепты буфера образца различаются. Выберите один основанный на рекомендации производителя электрофореза систему, которая будет занято.
- Инкубировать в течение 5 минут в кипящей водяной бане или 100 ° С электронным блоком тепло.
- Центрифуга на 10000 х г в течение 1 минуты. Immunoadsorbing антител, GR, и белки в комплексе с GR будет рассматриваться в отрыве друг от друга и выпущены в надосадочной буфера образца.
- Передача супернатант в новую пробирку микроцентрифужных использованием гофрированных наконечник P-200 пипетки чаевые. Откажитесь от гранул. Образца в настоящее время подготовлен для анализа с использованием коммерчески доступных SDS-PAGE или микрожидкостных систем электрофореза. Полное либо технику еосле инструкциям производителя.
- Вестерн-блот анализ следующих SDS-PAGE позволяет для окончательного определения immunoadsorbed GR и молекулярных шаперонов в комплексе с GR следующие восстановления инкубации. Использование моноклональных антител, первичная против GR (BuGR2), Hsp90 (AC88), hsp70 (N27F3-4) и со-шаперонов белков для выявления основных компонентов GR • Hsp90 белкового комплекса.
- Функциональные активации соли лишил GR следующие восстановление GR • Hsp90 белковый комплекс может быть идентифицирована путем анализа стероидных обязательным деятельности с использованием [3 H] стероидов (рис. 4). В течение оставшейся части протокола, следуйте необходимые меры предосторожности для безопасной обработки тритий образцов и отходов.
- Для восстановленного immunopellet, добавьте 47,5 мкл буфера HEM и 2,5 мкл 2 мкМ [3 H] дексаметазоном (конечная концентрация стероидных = 100 нм).
- Аккуратно перемешайте гранулы стараясь свести к минимуму количество образца перемещенных к стене микроцентрифужных трубки.
- Инкубируйте ночь на льду. Не стоит повернуть или смесь пробирок с образцами в течение этого инкубации.
- Добавить 1 мл TEGM буфера, аккуратно перемешать и центрифуге при 10000 х г в течение 1 минуты. Отменить супернатанта, вспоминая она содержит несвязанные [3 H] стероид. Повторите эти действия для в общей сложности 3 смывает с буфером TEGM.
- Полностью удалите супернатант при заключении окончательного смойте гофрированные P-200 пипетки чаевые. Гранула содержит Г.Р., Hsp90 и других молекулярных шаперонов в комплексе с GR, и [3 H] стероидных специфически связывается с рецептором. Неспецифическое связывание можно вычислить, в том числе 1000-кратного избытка не-тритием дексаметазона в ночь смесь инкубации. В качестве альтернативного отрицательный контроль, анти-GR immunoadsorbing антител добавили в шаге 2,2 могут быть заменены без GR-immunoadsorbing антител (NI).
- Приостановить мыть immunopellets в 200 мкл буфера TEGM и передачи до 10 мл сцинтилляционного флаконах использованием сократить P-200 пипетки чаевые.
- Добавить 4,8 мл сцинтилляционного коктейля флаконов и вихря.
- Количества [3 H] стероидных привязки к восстановленной GR • Hsp90 белковый комплекс может быть проанализированы с использованием жидкого сцинтилляционной спектрометрии.
6. Представитель Результаты:
Представитель SDS-PAGE и западной данных пятно, представлены на рисунке 3. Эндогенных GR • Hsp90 heterocomplex является immunoadsorbed от цитозоле клетки с использованием анти-GR антител и индивидуальных белков, которые совместно с immunoadsorb ОТО визуализируется Кумасси окрашивания (рис. 3А). Подтверждение белка личность какого-либо компонента immunopellet на любом этапе восстановления анализа могут быть сделаны SDS-PAGE расчета молекулярной массы и западных промокательной с использованием моноклональных антител, против белок.
Восстановленный GR • Hsp90 гетерокомплексов представлены с использованием электрофореза Experion микрожидкостных данных (рис. 3C и 3D) и западной блот-анализа (рис. 3В). Специфика GR иммуноадсорбции подтверждается замене immunoadsorbing анти-GR антитела с неиммунной антител (рис. 3, Н. И. IgG дорожек). Даже тогда, когда чрезмерное количество неиммунной антитела используются, нет GR или молекулярных шаперонов являются иммунопреципитации (см. на рис. 3C, GR, Hsp90 и hsp70 белковых полос, присутствующих в анти-GR полосы иммуноадсорбции с отсутствием группы наблюдались в Н. И. IgG дорожек). Точно так же можно утверждать, диссоциация Hsp90 и других белков шаперонов из соли лишил GR по-блот-анализ западных (рис. 3b) раздели и восстановленные immunopellets. Тяжелой цепи immunoadsorbing антител (HC) можно обнаружить как Кумасси пятно промокательной и западных, и это служит подтверждением равные по размеру immunopellets настоящее время визуализируется в каждом переулке.
Стероиды связывающей активности immunoadsorbed GR могут быть проанализированы на всех условий испытания, а также представитель стероидных обязательные данные представлены на рисунке 4. Эндогенные GR • Hsp90 гетерокомплексов являются immunoadsorbed, соль-раздевают, и восстановлена. Используя либо ретикулоцитов лизата или очищенных белков, стероидные связывающей активности восстановленного GR • Hsp90 heterocomplex обычно возвращается к 75-100% от эндогенных GR • Hsp90 уровня связывания деятельности. Как и электрофореза данных, неиммунной антител (NI), могут быть использованы вместо анти-GR антител (I) для того, чтобы служить в качестве отрицательного контроля и в качестве меры неспецифической [3 H] стероидных обязательными.
Рисунок 1. Модель GR • Hsp90 сборки heterocomplex и GR стероидных обязательным расщелина открытия. Hsp90/hsp70-based техники шаперона преобразует GR лиганд-связывающий домен из следуюДед конформации, в которых стероидные обязательным щель закрыта и недоступна для гормона открытых расщелина конформации которые могут быть доступны (иллюстрируется гетероциклические стероидных значок). Сопровождающих машин собранном в клетке и спонтанно образуются, когда очищенная Hsp90, Hsp70, и хоп смешиваются в растворе (реакция 1). Хоп содержит 34 аминокислот повторить tetratricopeptide кислоты (TPR) домена (показан в виде темных полумесяца), и впоследствии заменены в процессе созревания heterocomplex по TPR домена содержащих immunophilin белка. Техники открывает стероидных обязательным расщелина в ATP-и K +-зависимым способом, после чего хоп, и большинство из hsp70 и hsp40 в конечном итоге оставить комплекс (показан в виде пунктирной значок). Механистически, hsp70 взаимодействует с GR до Hsp90 и простых рецептором для Hsp90 и последующего открытия расщелины. Экспериментально, стероидные обязательными и GR расщелина открывания увеличивается, если Hsp90 и hsp70 одновременно присутствуют. Heterocomplex стабилизируется вступления Hsp90 совместно шаперона p23, который поддерживает Hsp90 в АТФ-связанной конформации. После выхода хоп, высоким молекулярным весом immunophilin (IMM) могут связываться Hsp90, образуя окончательное heterocomplex как он оправился от клетки. По материалам Пратт и Тофт 1.
Рисунок 2. Схематическое изображение Шаги 2-5 настоящего протокола. ОТО immunoadsorbed от цитозоле клетки использованием моноклональных антител, выдвигаемые против GR (FiGR), связанные с гранулы белка-сефарозой. Hsp90 и других белков, присутствующих в шаперона эндогенных GR • Hsp90 heterocomplex являются со-immunoadsorbed с GR и GR способен связываться с стероид. Hsp90 является отделена от GR используя мягкое лечение солью, называют соли зачистки (СТО). Стероидных обязательным расселине соли лишил GR закрывается, делая его неспособным связываться с стероид. Промежуточные GR • Hsp90 гетерокомплексов содержащие hsp70, hsp40, и хоп, которые способны связывать стероидные, может быть восстановлена (Recon) путем инкубации соли лишил GR с очищенными белками или ретикулоцитов лизат (Retic лизат) и кофакторов. Стероидных связывающей активности и immunopellet содержание белка в каждый шаг может быть идентифицирован ночь [3 H] стероидных инкубации и западных промокательной, соответственно.
Рисунок 3. Электрофоретический анализ белка immunoadsorbed комплексов. , SDS-PAGE восстановленного GR • Hsp90 heterocomplex отображаемого использованием обычной системы электрофореза следует электропереноса и Кумасси окрашивания. В дополнение к GR, Hsp90 и Hsp70, тяжелой цепью (НС) и легкой цепи (LC) антител визуализируются. Миграция маркеры молекулярного веса (в кДа) указаны на левой. B, иммуноблоттинга из immunopellets содержащие соли лишил GR (Str) и восстановленного GR • Hsp90 heterocomplex (Recon). С виртуальными гель восстановленного GR • Hsp90 heterocomplex создан с помощью электрофореза Experion микрожидкостных системы. Два разных концентрациях неиммунной (Н. И. IgG) и иммунные (анти-GR) immunoadsorbing антител включены. Н. И. IgGs служить отрицательные контроли. D, electropherogram восстановленного GR • Hsp90 heterocomplex получена из Experion микрожидкостных электрофорез образца, показанного на третьем ряду панелей Преимущества Б. из микрожидкостных электрофореза включать требование для небольших объемов проб, снижение наливных и после выполнения очистки, улучшение количественных и существенно короче пример работает.
Рисунок 4. Стероиды связывающей активности immunopellets следующие иммуноадсорбции эндогенных GR (Enodg), соль-раздели GR (ул), а также восстановленные GR • Hsp90 heterocomplex (Recon). В дополнение к immunoadsorbing GR с моноклональными анти-GR immunoadsorbing антител (I), отрицательные контрольные образцы для каждого условия были приготовлены с использованием неиммунной иммуноглобулина (NI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализа, описанного выше, может быть адаптирована для проверки множества условий, влияющих на действия шаперонов hsp90/hsp70-based техники шаперона а также GR стероидных обязательными. Она является модификацией ранее сообщалось методы 4,8,9,17 и предназначен, чтобы воспользоваться последними достижениями в технологии электрофореза и быть доступными для более широкого научного сообщества. Дополнительная кофакторов или белки интересов может быть добавлен к GR • Hsp90 heterocomplex восстановления смеси, описанные в пункте 4 протокола, с целью наблюдения за влияние на стероидные обязательными, heterocomplex белок-белковых взаимодействий, а также сопутствующим фактором требованиям. Например, последствия ишемии на Hsp90 функции могут быть смоделированы с добавлением повышение концентрации активных форм кислорода. Очищенные белки с особенностью (например, ацетилированный Hsp90) или потенциальных ингибиторов Hsp90 (например, аналоги роман гелданамицина) может быть добавлен для того, чтобы их влияние на стероидные обязательными и heterocomplex образованию предстоит определить.
Вниз по течению анализов отличаются от электрофореза, западной промокательной, и стероидных обязательные тесты также могут быть использованы. Например, иммунопреципитации комплексов multiprotein были проанализированы с помощью проточной цитометрии с существенным успехом 18,19. Immunoadsorbed GR • Hsp90 комплексы могут быть также исследованы на hsp90/hsp70 нуклеотидных государственной или визуализированы с помощью атомно-силовой микроскопии 17. Hsp90 клиента белки, кроме GR может использоваться (например, контрольно-пропускной пункт chaperoning киназы I (Chk1) 20), а семенной исследования были проведены с использованием вариантов этого протокола с рецептором эстрогена, прогестерона и Src 1,13,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Выберите электрофореза реагенты и программное обеспечение для анализа изображений были предоставлены Bio-Rad.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась Национальным институтом здоровья грант GM086822, Надежда института сердца фундаментальных наук награду, и MJ Мердок Благотворительный фонд колледжа науки исследовательской программы. Выберите электрофореза реагенты и программное обеспечение для анализа изображений щедро предоставляемые Bio-Rad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. estern Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
