Summary
Een
Abstract
Hsp90 is een essentieel en zeer overvloedige moleculaire chaperonne-eiwit dat is gevonden om meer dan 150 eukaryote signaaleiwitten, waaronder transcriptie factoren (bv. nucleaire receptoren, p53) en proteïne kinases (bijv. Src, Raf, Akt kinase) die betrokken zijn in cel fietsen te reguleren, ontstaan van tumoren, apoptose, en meerdere eukaryote signaleringsroutes 1,2. Van deze vele 'klant' eiwitten voor hsp90, de assemblage van steroïde receptoren • hsp90 complexen is gedefinieerd de beste (Figuur 1). We presenteren hier een aanpasbaar glucocorticoid receptor (GR) immunoprecipitatie assay en in vitro GR • hsp90 reconstructie methode die gemakkelijk kunnen worden gebruikt om de eukaryote hsp90 functionele activiteit, hsp90-gemedieerde steroïde receptor ligand binding, en moleculaire chaperone cofactor eisen sonde. Bijvoorbeeld, kan deze test gebruikt worden om hsp90 cofactor eisen en de effecten van het toevoegen van exogene verbindingen aan de reconstitutie te testen.
De GR is een bijzonder handig systeem voor het bestuderen van hsp90, omdat de receptor moet worden gebonden aan hsp90 naar een open kloof ligand binding die toegankelijk is voor steroïde 3 hebben. Endogene, unliganded GR is aanwezig in het cytoplasma van zoogdiercellen niet-covalent gebonden aan hsp90. Zoals gevonden in de endogene GR • hsp90 heterocomplex, de GR gespleten ligand binding is open en in staat te binden steroïde. Als hsp90 distantieert van de GR, of als de functie wordt geremd, de receptor niet in staat is te binden steroïde en vereist reconstitutie van het GR • hsp90 heterocomplex voor steroïde-bindende activiteit wordt hersteld 4. GR kan worden immunogeprecipiteerd van cel cytosol met behulp van een monoklonaal antilichaam, en eiwitten zoals hsp90 gecomplexeerd aan de GR kan worden getest door western blot. Steroïde-bindende activiteit van de immunogeprecipiteerd GR kan worden bepaald door het incuberen van de immunopellet met [3 H] steroïde.
Eerdere experimenten hebben aangetoond hsp90-gemedieerde opening van de GR gespleten ligand binding vereist hsp70, een tweede moleculaire chaperon ook essentieel voor de eukaryote cel levensvatbaarheid. Biochemische activiteit van hsp90 en hsp70 worden gekatalyseerd door co-chaperonne-eiwitten Hop, hsp40, en P23 5. Een multiprotein chaperonne apparatuur die hsp90, hsp70, Hop, en hsp40 zijn endogeen aanwezig zijn in eukaryote cel cytoplasma, en de reticulocyten lysaat biedt een chaperonne-rijk eiwit bron 6.
In de gepresenteerde methode, is GR immunoadsorbed van cel cytosol en ontdaan van de endogene hsp90/hsp70 chaperonne machines met een milde zout omstandigheden. Het zout-gestripte GR wordt vervolgens geïncubeerd met reticulocyten lysaat, ATP, en K +, wat resulteert in de reconstructie van de GR • hsp90 heterocomplex en reactivering van steroïde-bindende activiteit 7. Deze methode kan worden gebruikt om de effecten van verschillende chaperonne co-factoren, nieuwe eiwitten, en experimentele hsp90 of GR-remmers test in om hun functionele betekenis op hsp90-gemedieerde steroïde-bindende 8-11 te bepalen.
Protocol
1. De voorbereiding van de cel cytosol met functionele GR
- Technische noot: Alle buffers moeten worden gekoeld en elke stap van dit protocol, met inbegrip van centrifugations en incubatie, moeten uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C, tenzij anders vermeld. De lage temperatuur is essentieel voor de afbraak van de GR en eiwit-complexen te voorkomen.
- Met behulp van een gekoelde centrifuge, het verkrijgen van een ~ 1-5 ml pellet van cellen die een hoge concentratie van functionele GR uitdrukt. Voorbeelden van cel bronnen rijk aan GR onder andere muis fibroblast L929 cellen, die een hoge concentratie van endogene GR te uiten, en Sf9 cellen die zijn geïnfecteerd met recombinant baculovirus GR (bijvoorbeeld de p2Bac-MGR baculovirus 12). Ongeveer 15-20 ml van verpakte cellen wordt verkregen per liter van Sf9 baculovirus celcultuur. De cellen moeten worden exponentieel groeiende vóór de oogst. Centrifugeer de celsuspensie bij 5.000 xg gedurende 5 minuten.
- Was de celpellet drie keer met 15 ml zoutoplossing Hanks '. Tussen wast voorzichtig resuspendeer de pellet, gevolgd door centrifugeren bij 5000 xg gedurende 5 minuten. Na de laatste wassen, verwijdert u de supernatant.
- Bereid 7,5 ml van een homogenisering buffer met HEM buffer (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mM natriummolybdaat, pH 7,4), 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), en drie gemalen tabletten Complete-Mini protease remmer. De PMSF en de Complete-Mini tabletten te voorkomen dat proteolyse zich voordoet tijdens de daaropvolgende stappen. Compleet-Mini tabletten kunnen gemakkelijk worden gemalen tot een fijn poeder met een mortier en een stamper. Voeg 1,5 volumes van homogenisering buffer naar de cel pellet.
- Breuk van de cellen door Dounce homogenisatie (50 slagen) of vries / dooi (3 cycli) techniek. Dounce homogenisering kunnen handhaven verbeterde endogene GR • hsp90 eiwitcomplexen en is sneller te voltooien. Vorst / dooi biedt onderzoeker een mogelijkheid om het protocol te schorsen bij deze stap en ga op een later tijdstip. Dounce homogenisering moet worden uitgevoerd met de homogenisator in een ijsemmer om eiwit degradatie te voorkomen. Vorst / dooi kan worden bereikt door het bevriezen van de centrifugebuis met het celpellet-homogenisering buffer mengsel met vloeibare stikstof, droog ijs, of -20 ° C incubatie, gevolgd door ontdooien in een 30 ° C waterbad.
- Scheid de GR-bevattende cytosol van de cel gescheurde fijn stof door ultracentrifugatie. Breng de homogenaat om duurzame ultracentrifuge tubes, evenwicht buizen door massa in paren, en centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 30 minuten.
- Verwijder de cytosol (supernatant) en bewaar bij -20 ° C in 500 pi aliquots in 1,5 ml microcentrifugebuizen voor langdurige opslag. Te behouden maximale functionele GR-activiteit, flash-vries de monsters in vloeibare stikstof of incubeer gedurende 30 seconden in een methanol-droogijs bad voorafgaand aan de opslag. Wees voorzichtig met direct huidcontact met de koeling reagens te voorkomen.
2. Immunoadsorption van de GR van de cel cytosol
- Technische noot: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van de stappen 2-5 van dit protocol.
- Bereid een immunoadsorption mengsel met een monoklonaal immunoglobuline G (IgG) antistoffen gemaakt tegen de GR aan de receptor bereid in stap 1 immunoadsorb. In een 1,5 ml microcentrifugebuis, combineer 100 ul ontdooid GR-bevattende cytosol, 200 ul TEGM buffer (8 mM TES, 4 mM EDTA, 50 mM NaCl, 20 mM molybdaat, 10% (v / v) glycerol, pH 7,6) , 100 ul van een 20% eiwit A-Sepharose (PAS) drijfmest (v / v, bereid in TEGM buffer), en 5 ug van anti-GR monoklonaal IgG antilichaam (bijv. BuGR2). Molybdaat is opgenomen in de TEGM buffer om te helpen bij het stabiliseren van de GR-hsp90 heterocomplex, die nuttig kan zijn om de test endogene heterocomplex steroïde-bindende activiteit 13.
- Anti-GR antilichaam is commercieel beschikbaar als gezuiverde eiwit. Als alternatief kan het worden verkregen door toevoeging van 10 ul van anti-GR IgG-bevattende ascites aan de immunoadsorption mengsel. Ascites wordt geproduceerd door muizen geïnjecteerd met anti-GR hybridoma-cellen (bijv. FiGR hybridoma-cellen 14), evenals de antilichaamconcentratie verkregen van ascites en gebruikt in deze experimenten was 0,5 ng / ul, zoals gemeten door Bradford assay.
- Bereid een negatieve controle monster met behulp van GR-bevattende cytosol, TEGM buffer, en PAS (zoals hierboven beschreven), en 5 ug van een IgG dat niet wordt herkend van de GR, hsp90, of een andere moleculaire chaperone eiwitten (aangeduid als een "nonimmune" antilichaam).
- Door de relatief grote PAS kraal omvang, gebruik een cut P-200 pipet tip bij het overbrengen van PAS van de 20% drijfmest op monsterbuizen. Snijd pipet tips worden voorbereid door het snijden van 2-3 mm af van het einde van commercieel beschikbare P-200 tips, waardoor de pipet tip diafragma.
- Leg monsters op een verticale draaiende wiel en incubeer voor een minimum van 2 uur met constante rotatie. Monsters kunnenworden geïncubeerd tot 8 uur zonder verlies van activiteit.
- Aan het einde van de immunoadsorption incubatie, verwijder niet-gebonden eiwitten uit het antilichaam-PAS pellet ("immunopellet") door middel van centrifugeren. Scheid de supernatanten van immunopellets door centrifugeren met behulp van een gekoelde centrifuge geprogrammeerd voor 1 minuut bij 10.000 xg, en vervolgens twee keer wassen met 1 ml TEGM buffer en vortex. Na centrifugatie en tussen de wasbeurten, gooi het supernatant wordt voorzichtig niet te storen de korrel.
- Verwijder al het supernatant aan het einde van de tweede wassen. Om ervoor te zorgen geen enkele van de pellet is per ongeluk opgezogen, gebruik dan een gekrulde P-200 pipet tip voor de uiteindelijke supernatant aspiratie. Geplooid pipet tips worden bereid door pletten commercieel beschikbare P-200 tips met behulp van een tang.
3. Dissociatie van endogene hsp90 uit GR immunopellet ("Salt stripping")
- Om de gewassen immunopellet bereid in stap 2, voeg 355 ul TEG buffer (TEGM buffer zonder natriummolybdaat) en 45 pl van 5 M NaCl (uiteindelijke NaCl-concentratie = 0,5 M).
- Leg monsters op een verticale draaiende wiel en incubeer gedurende 1,5 uur met constante rotatie. Monsters kunnen worden geïncubeerd tot 2 uur, maar langer incubaties kan leiden tot een verminderde eiwit herstel en een lagere functionele activiteit.
- Verwijder de niet-gebonden eiwitten uit de immunopellet door centrifugeren. Spin monsters gedurende 1 minuut bij 10.000 x g. Was eenmaal met 1 ml TEG buffer en een keer met 1 ml van 10 mM HEPES buffer, pH 7,4.
- Verwijder al het supernatant aan het einde van de tweede wassen, zorg dat u de immunopellet verstoren, met behulp van een gekrulde P-200 pipet tip.
4. Reconstitutie van GR • hsp90 heterocomplex met behulp van moleculaire chaperones, co-factoren, en ATP
- Technische noot: Een groot aantal experimentele omstandigheden kunnen worden getest door het opnemen van extra eiwitten, cofactoren, activators of remmers van belang in de reconstructie mengsel hieronder voorbereid. Totaal volume van reconstitutie mengsels <120 ul worden.
- Om elk zout-gestript immunopellet bereid in stap 3, voeg een reconstructie mengsel dat 50 ul van een moleculaire chaperonne bron en 5 ul van een ATP-genererend systeem (10 mM HEPES, 50 mM ATP, 250 mM creatine fosfaat, 20 mM magnesiumacetaat , 100 U / ml creatinefosfokinase, pH 7,4).
- Reconstitutie reacties kunnen worden verhoogd door aanvulling van de reconstitutie mengsel met 50 ul HKD buffer (10 mM HEPES, 100 mM KCl, 5 mM dithiothreitol (DTT), pH 7,4) en een extra 5 ul van ATP-genererende systeem. Deze stap kan worden weggelaten als voldoende reconstitutie en steroïde-bindende in acht worden genomen. KCl verhoogt Hsp70 ATPase activiteit en DTT beschermt cysteïne-bevattende eiwitten uit oxidatie 9.
- Een aanbevolen moleculaire chaperone bron is commercieel beschikbaar konijn reticulocyten lysaat. Individuele moleculaire chaperones gezuiverd van reticulocyt lysaat of recombinant uitgedrukt (bv. 15 microgram hsp90, 15 microgram hsp70, 0,6 microgram Hop, 6 ug P23, en 0.125 microgram hsp40 in HKD buffer) kan ook worden gebruikt.
- Incubeer monsters in een 30 ° C waterbad voor exact 20 minuten. Flick buizen om de 1-2 minuten, zodat u langzaam verstoren de pellet en meng de reconstitutie oplossing.
- Voeg 1 ml TEGM buffer, vortex, en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut. Verwijder supernatant af en gooi en let niet op de pellet te verstoren. Herhaal dit voor een totaal van drie wasbeurten. Volledig te verwijderen alle supernatant aan het einde van de laatste wassen met een gekrulde P-200 pipet tip.
5. Analyse van de gereconstitueerde eiwitcomplexen en ligand bindende activiteit
- Eiwitten in de gereconstitueerde immunopellet kan worden geïdentificeerd door middel van conventionele denaturerende polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE), microfluïdische elektroforese (bv. Bio-Rad Experion) en Western blotting (afb. 3). Technische noot: Uitstekend protocollen beschrijven van SDS-PAGE 15 en western blotting 16 zijn op dit moment beschikbaar zijn, met dank aan andere onderzoekers.
- Voeg 50 ul van SDS-PAGE sample buffer met β-mercaptoethanol en vortex. Specifieke sample buffer recepten variëren. Selecteer een gebaseerd op de aanbevelingen van de fabrikant van de elektroforese het toe te passen.
- Incubeer gedurende 5 minuten in een bad met kokend water of 100 ° C elektronische warmte te blokkeren.
- Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut. De immunoadsorbing antilichaam, GR, en eiwitten een complex aan GR wordt los gezien worden van elkaar en vrijgelaten in het monster buffer supernatant.
- Breng het supernatant naar een nieuwe microcentrifugebuis met behulp van een gekrompen tip P-200 pipet tip. Gooi de pellet. Het monster is nu klaar voor analyse met behulp van commercieel verkrijgbare SDS-PAGE of microfluïdische elektroforese systemen. Volledige of techniek fadat instructies van de fabrikant.
- Western blot analyse na de SDS-PAGE zorgt voor de definitieve identificatie van de immunoadsorbed GR en moleculaire chaperonnes gecomplexeerd aan de GR na de reconstitutie incubatie. Gebruik monoklonale primaire antilichamen opgewekt tegen GR (BuGR2), hsp90 (AC88), hsp70 (N27F3-4) en co-chaperonne-eiwitten om de belangrijkste onderdelen van de GR • hsp90 eiwitcomplex op te sporen.
- Functionele activering van de zout-gestripte GR na reconstructie van de GR • hsp90 eiwitcomplex kan worden geïdentificeerd door het testen van steroïde-bindende activiteit met behulp van een [3 H] steroïde (afb. 4). Voor de rest van het protocol, volgt u de nodige voorzorgsmaatregelen voor het veilig omgaan tritiumhoudend monsters en afval.
- Om de gereconstitueerde immunopellet, voeg 47,5 pl HEM buffer en 2,5 pl van 2 uM [3 H] dexamethason (uiteindelijke steroïde concentratie = 100 nM).
- Meng de pellet voorzichtig om de hoeveelheid van het monster verplaatst naar de wand van de microcentrifugebuis te minimaliseren.
- Incubeer overnacht op het ijs. Het is niet nodig om te draaien of de monsterbuizen mix gedurende deze incubatie.
- Voeg 1 ml TEGM buffer, meng, en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 1 minuut. Verwijder het supernatant, die bewust het bevat ongebonden [3 H] steroïde. Herhaal dit voor een totaal van 3 wassingen met TEGM buffer.
- Volledig te verwijderen alle supernatant aan het einde van de laatste wassen met een gekrulde P-200 pipet tip. De korrel bevat GR, hsp90 en andere moleculaire chaperonnes gecomplexeerd aan de GR, en de [3 H] steroïde specifiek gebonden aan de receptor. Niet-specifieke binding kan worden berekend door het opnemen van 1000-voudige overmaat niet-getritieerde dexamethason bij de overnachtingsprijs incubatiemengsel. Als een alternatieve negatieve controle, het anti-GR immunoadsorbing antilichaam toegevoegd in stap 2.2 kan worden vervangen door een niet-GR-immunoadsorbing antilichaam (NI).
- Hang de gewassen immunopellets in 200 ul TEGM buffer en over te dragen aan 10 ml scintillatieflesjes met behulp van een cut P-200 pipet tip.
- Voeg 4,8 ml scintillatiecocktail om de flesjes en vortex.
- De hoeveelheid [3 H] steroïden binden aan het opgeloste GR • hsp90 eiwit complex kan worden getest met behulp van vloeistofscintillatietelling spectrometrie.
6. Representatieve resultaten:
Vertegenwoordiger van SDS-PAGE en western blot gegevens zijn weergegeven in figuur 3. De endogene GR • hsp90 heterocomplex is immunoadsorbed van cel cytosol gebruik van anti-GR antilichaam en individuele eiwitten die co-immunoadsorb met de GR worden gevisualiseerd door Coomassie kleuring (Fig. 3A). Bevestiging van eiwitten identiteit van een onderdeel van de immunopellet bij elke stap in de reconstructie-test kan worden gedaan door SDS-PAGE berekening van de moleculair gewicht en western blotting met behulp van monoklonale antilichamen die zijn opgewekt tegen het eiwit van belang.
Gereconstitueerde GR • hsp90 heterocomplexes worden gepresenteerd met behulp van Experion microfluïdische elektroforese gegevens (Fig. 3C en 3D) en de western blot analyse (Fig. 3B). De specificiteit van de GR immunoadsorption wordt bevestigd door het vervangen van de immunoadsorbing anti-GR antilichaam met een nonimmune antilichaam (Fig. 3C, NI IgG rijstroken). Zelfs wanneer grote hoeveelheden van nonimmune antilichamen worden gebruikt, zijn geen GR of moleculaire chaperonnes immunogeprecipiteerd (vgl. in Fig. 3C, de GR, hsp90 en hsp70 eiwitbanden aanwezig is in de anti-GR immunoadsorption lanen met het gebrek aan band waargenomen in de NI IgG rijstroken). Ook is het mogelijk om de dissociatie van hsp90 en andere chaperone eiwitten bevestigen van het zout-gestripte GR door western blot analyse (Fig. 3B) van de gestripte en opnieuw immunopellets. De zware keten van het antilichaam immunoadsorbing (HC) is detecteerbaar door zowel Coomassie vlek en western blotting, en dient op gelijke grootte immunopellets bevestigen worden gevisualiseerd in elke baan.
Steroïde-bindende activiteit van de immunoadsorbed GR kan worden getest door voor alle geteste omstandigheden, en representatieve steroïde-bindende gegevens zijn weergegeven in Figuur 4. Endogene GR • hsp90 heterocomplexes zijn immunoadsorbed, zout-gestript, en opnieuw. Met behulp van reticulocyt lysaat of gezuiverde eiwitten, steroïde-bindende activiteit van het opgeloste GR • hsp90 heterocomplex levert doorgaans tot 75-100% van de endogene GR • hsp90 bindende activiteit niveau. Net als bij de elektroforese gegevens kan een nonimmune antilichaam (NI) worden gebruikt in plaats van de anti-GR antilichaam (I) om te dienen als een negatieve controle en als een maatregel van niet-specifieke [3 H] steroïde bindend.
Figuur 1. Model van de GR • hsp90 heterocomplex montage-en GR-steroïde-bindende gespleten opening. De hsp90/hsp70-based chaperonne machines zet de GR ligand bindend domein van een folDED conformatie waarin de kloof steroïde-bindende gesloten is en niet toegankelijk zijn voor hormonen naar een open conformatie kloof die toegankelijk is (geïllustreerd door de heterocyclische steroïde pictogram). De chaperonne machines is voorgemonteerd in de cel en zal spontaan ontstaan wanneer gezuiverd hsp90, Hsp70 en Hop zijn gemengd in oplossing (reactie 1). Hop bevat een 34 aminozuur tetratricopeptide herhalen (TPR) domein (afgebeeld als een donkere halve maan), en is later vervangen tijdens de heterocomplex rijpingsproces door een TPR domein-bevattende immunofiline eiwit. De machines opent de steroïde-bindende spleet in een ATP-en K +-afhankelijke manier, waarna verlaten Hop en het merendeel van de Hsp70 en hsp40 uiteindelijk het complex (geïllustreerd als een gestippelde icoon). Mechanistisch, Hsp70 interageert met de GR voorafgaand aan de hsp90 en priemgetallen de receptor voor hsp90 en de daaropvolgende gespleten opening. Experimenteel, zijn steroïde bindend en GR gespleten opening verhoogd als hsp90 en hsp70 zijn gelijktijdig aanwezig zijn. De heterocomplex wordt gestabiliseerd door het invoeren van de hsp90 co-chaperonne p23, die hsp90 handhaaft in een ATP-gebonden conformatie. Na de afslag van Hop, kan een hoog moleculair gewicht immunofiline (IMM) te binden hsp90, de vorming van de uiteindelijke heterocomplex als het is hersteld van cellen. Aangepast van Pratt en Toft 1.
Figuur 2. Schematische weergave van de stappen 2-5 van dit protocol. De GR is immunoadsorbed van cel cytosol met behulp van een monoklonaal antilichaam opgewekt tegen de GR (FiGR) gebonden aan een pellet van proteïne A-Sepharose. Hsp90 en andere chaperone eiwitten aanwezig zijn in het endogene GR • hsp90 heterocomplex zijn co-immunoadsorbed met de GR, en de GR is in staat om te binden aan steroïde. Hsp90 is losgekoppeld van GR met een mild zout behandeling, aangeduid als zout-strippen (Str). De steroïde-bindende kloof van de zout-gestripte GR sluit, waardoor het niet in staat om te binden aan steroïde. Intermediaire GR • hsp90 heterocomplexes met hsp70, hsp40, en Hop, die in staat zijn te binden steroïden, kunnen worden gereconstitueerd (Recon) door het incuberen van de zout-gestripte GR met gezuiverde eiwitten of reticulocyten lysaat (Retic lysaat) en co-factoren. De steroïde-bindende activiteit en immunopellet eiwitgehalte van elke stap kan worden geïdentificeerd door 's nachts [3 H] steroïde incubatie-en western blotting, respectievelijk.
Figuur 3. Elektroforetisch eiwit analyse van immunoadsorbed complexen. A, SDS-PAGE van gereconstitueerde GR • hsp90 heterocomplex beeld gebracht met behulp van conventionele elektroforese-systeem, gevolgd door Electroforetisch en Coomassie kleuring. Naast de GR, hsp90 en hsp70, de zware keten (HC) en lichte keten (LC) van de antilichamen worden gevisualiseerd. Migratie van moleculair gewicht merkers (uitgedrukt in kDa) zijn aangegeven aan de linkerkant. B, Western blot van immunopellets met zout-gestript GR (Str) en gereconstitueerde GR • hsp90 heterocomplex (Recon). C, virtuele gel van gereconstitueerde GR • hsp90 heterocomplex gegenereerd met behulp van een Experion microfluïdische elektroforese-systeem. Twee verschillende concentraties van een nonimmune (NI IgG) en het immuunsysteem (anti-GR) immunoadsorbing antilichamen zijn inbegrepen. NI IgGs dienen als negatieve controles. D, electropherogram van gereconstitueerde GR • hsp90 heterocomplex verkregen uit Experion microfluïdische elektroforese voorbeeld getoond in het derde rijvak van het paneel B. Voordelen van microfluïdische elektroforese onder meer de eis voor kleinere monstervolumes, verminderde liquid handling-en post-run opschonen, verbeterde kwantificering, en aanzienlijk kortere sample loopt.
Figuur 4. Steroïde-bindende activiteit van immunopellets volgende immunoadsorption van endogene GR (Enodg), zout-gestript GR (Str), en gereconstitueerde GR • hsp90 heterocomplex (Recon). In aanvulling op immunoadsorbing de GR met een monoklonaal anti-GR immunoadsorbing antilichaam (I), werden negatieve controlemonsters voor elke voorwaarde bereid met behulp van een nonimmune immunoglobuline (NI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De test hierboven beschreven kan worden aangepast aan een groot aantal aandoeningen van de chaperonne acties van de hsp90/hsp70-based chaperonne machines, alsook GR steroïde-bindende test. Het is een wijziging van de eerder gerapporteerde methoden 4,8,9,17 en is ontworpen om te profiteren van recente ontwikkelingen in de elektroforese-technologie en toegankelijk voor een breder onderzoek gemeenschap. Extra cofactoren of eiwitten van belang kunnen worden toegevoegd aan de GR • hsp90 heterocomplex reconstitutie mengsel, zoals beschreven in stap 4 van het protocol, om de effecten op de steroïde-bindende, heterocomplex eiwit-eiwit interacties, en co-factor in acht te nemen. Bijvoorbeeld, kunnen de effecten van ischemie-reperfusie op hsp90 functie gemodelleerd worden met de toevoeging van toenemende concentraties van een reactieve zuurstofradicalen. Gezuiverde eiwitten met een specifieke eigenschap (bv. geacetyleerd hsp90) of potentiële hsp90-remmers (bijv. roman geldanamycin analogen) kan worden toegevoegd om op hun effecten op de steroïde-bindende en heterocomplex formatie te bepalen.
Downstream-assays anders dan elektroforese, kan western blotting, en steroïde bindingstesten ook gebruikt worden. Zo hebben immunogeprecipiteerd multiprotein complexen geanalyseerd door middel van flowcytometrie met groot succes 18,19. De immunoadsorbed GR • hsp90 complexen kan ook worden getest op hsp90/hsp70 nucleotide staat of gevisualiseerd met behulp van atomic force microscopie 17. Hsp90 opdrachtgever andere eiwitten dan de GR mag worden gebruikt (bv. chaperonneren checkpoint kinase I (Chk1) 20), en baanbrekende onderzoek is uitgevoerd in varianten van dit protocol met de oestrogeen receptor, progesteron receptor, en Src 1,13,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Selecteer elektroforese reagentia en beeldanalyse-software werden geleverd door Bio-Rad.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health te verlenen GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences Award, en de MJ Murdock Charitable Trust College Science Research Program. Selecteer elektroforese reagentia en beeldanalyse-software werden genereus geleverd door Bio-Rad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. estern Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
