Summary
Ein
Abstract
Hsp90 ist ein wesentlicher und sehr reichlich molekularen Chaperon-Protein, das gefunden wurde, mehr als 150 eukaryotischen Signalproteine, einschließlich Transkriptionsfaktoren (zB nukleare Rezeptoren, p53) und Proteinkinasen (zB Src, Raf, Akt-Kinase) in Zellzyklus beteiligt zu regeln, Tumorgenese, der Apoptose, und mehrere eukaryotischen Signalwege 1,2. Von diesen vielen "Kunden" Proteine für hsp90, die Montage von Steroid-Rezeptor • hsp90-Komplexen ist die beste definiert (Abb. 1). Wir stellen Ihnen hier eine anpassungsfähige Glucocorticoid-Rezeptor (GR) Immunpräzipitationsassay und in vitro GR • hsp90 Rekonstitution Methode, die ohne weiteres eingesetzt werden kann, um eukaryotische hsp90 funktionelle Aktivität, hsp90-vermittelte Steroid-Rezeptor-Liganden-Bindung und der molekularen Chaperon-Cofaktor Anforderungen Sonde. Zum Beispiel kann dieses Tests verwendet werden, um hsp90 Cofaktor Anforderungen und die Auswirkungen der Zugabe von exogenen Verbindungen zur Rekonstitution Verfahren zu testen.
Der GR hat ein besonders nützliches System für das Studium hsp90 worden, weil der Rezeptor hsp90 gebunden sein muss, um eine offene Ligandenbindung Spalt, auf den Steroid-3 ist zu haben. Endogene, unliganded GR ist im Zytoplasma von Säugerzellen kovalent an hsp90 gebunden. Wie in den endogenen GR • hsp90 Heterokomplex gefunden, wird der GR-Liganden Bindungsschlucht öffnen und binden Steroid. Wenn hsp90 distanziert sich von der GR oder wenn seine Funktion ist gehemmt, ist der Rezeptor nicht binden Steroid und die Rekonstitution des GR • hsp90 Heterokomplex vor steroid-bindenden Aktivität ist 4 restauriert. GR aus Zellcytosol mit einem monoklonalen Antikörper immunpräzipitiert, und Proteine, wie zB hsp90 im Komplex mit dem GR mittels Western Blot getestet werden kann. Steroid Bindungsaktivität des immunpräzipitiert GR kann durch Inkubation der immunopellet mit [3 H] Steroid bestimmt werden.
Frühere Experimente haben hsp90-vermittelte Öffnung der GR Ligandenbindung Spalt gezeigt, erfordert hsp70, ein zweiter molekularer Chaperone auch wichtig für eukaryontische Lebensfähigkeit der Zellen. Biochemische Aktivität von hsp90 und hsp70 werden durch Co-Chaperon-Proteinen Hop, Hsp40 und p23 5 katalysiert. Ein Multiprotein Chaperon Maschinen mit hsp90, hsp70, Hop und Hsp40 sind endogen in eukaryotischen Zelle Zytoplasma vorhanden ist, und Retikulozytenlysat bietet ein Chaperon-reiches Protein Quelle 6.
In dem vorgestellten Verfahren ist GR aus Zellcytosol immunoadsorbed und gestrippt des endogenen hsp90/hsp70 Chaperon Maschinen mit einer milden Salz Bedingungen. Das Salz-abgestreift GR wird dann mit Retikulozytenlysat, ATP und K +, die in die Wiederherstellung der GR Ergebnisse inkubiert • hsp90 Heterokomplex und Reaktivierung von Steroid-bindenden Aktivität 7. Diese Methode kann genutzt werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Chaperon-Cofaktoren, neuartige Proteine und experimentelle hsp90 oder GR-Inhibitoren zu testen, um ihre funktionelle Bedeutung auf hsp90-vermittelte Steroid verbindlich 8-11 zu bestimmen.
Protocol
1. Vorbereitung der Zellcytosol mit funktionellen GR
- Technischer Hinweis: Alle Puffer sollte im Kühlschrank aufbewahrt werden und jeder Schritt dieses Protokoll, einschließlich Zentrifugationen und Inkubation, sollte auf Eis oder bei 4 ° C durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Die niedrige Temperatur ist notwendig, um den Abbau der GR-und Protein-Komplexe zu verhindern.
- Mit einer Kühlzentrifuge, erhalten eine ~ 1-5 ml Pellet von Zellen, die eine hohe Konzentration von funktionellen GR ausdrückt. Beispiele für Zell-Quellen reichen in GR sind Maus-Fibroblasten L929-Zellen, die eine hohe Konzentration von endogenen GR ausdrücken und Sf9-Zellen, die mit rekombinantem Baculovirus GR (zB die p2Bac-MGR Baculovirus 12) infiziert wurden. Ca. 15-20 ml gepackte Zellen pro Liter Sf9 Baculovirus Zellkultur erhalten. Die Zellen sind exponentiell wachsen vor der Ernte. Centrifuge die Zellsuspension bei 5.000 × g für 5 min.
- Waschen Sie die Zellpellet dreimal mit 15 ml Kochsalzlösung Hanks 'Lösung. Zwischen wäscht sanft das Pellet durch Zentrifugation bei 5.000 gefolgt xg für 5 min. Nach der letzten Waschung vollständig zu entfernen Überstand.
- Bereiten Sie 7,5 ml einer Homogenisierung Puffer mit HEM-Puffer (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mM Natriummolybdat, pH 7,4), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und 3 Boden Tabletten Complete-Mini Protease-Inhibitor. Die PMSF und Complete-Mini-Tabletten verhindern Proteolyse aus, die während der nachfolgenden Schritte. Complete-Mini Tabletten können leicht zu einem feinen Pulver mit einem Mörser und Stößel gemahlen werden. Add 1,5 Volumina Homogenisierungspuffer zum Zellpellet.
- Rupture die Zellen durch Dounce Homogenisierung (50 Schläge) oder Frost / Tau (3 Zyklen)-Technik. Dounce Homogenisierung kann zu halten verbesserte endogene GR • hsp90-Protein-Komplexen und ist schneller zu beenden. Frost / Tau stellt Forscher die Möglichkeit, das Protokoll zu diesem Schritt aussetzen und weiter zu einem späteren Zeitpunkt. Dounce Homogenisierung sollte mit dem Homogenisator in einem Eiskübel auf Proteinabbau zu verhindern durchgeführt werden. Frost / Tau kann durch Einfrieren der Zentrifugenröhrchen mit dem Zellpellet-Homogenisierungspuffer Mischung mit flüssigem Stickstoff, Trockeneis, oder -20 erfolgen ° C Inkubation durch Auftauen in einem 30 ° C Wasserbad.
- Trennen Sie die GR-haltigen Cytosol aus der geplatzten Zelle Feinstaub durch Ultrazentrifugation. Übertragen Sie die Homogenat dauerhafte Ultrazentrifuge Rohre, Rohre Gleichgewicht von Masse in Paaren, und Zentrifuge bei 100.000 × g für 30 Minuten.
- Entfernen Sie das Zytosol (Überstand) und bei -20 ° C in 500 ul Aliquots in 1,5 ml Reaktionsgefäße für die langfristige Lagerung. Zur Erhaltung maximale Funktionssicherheit GR-Aktivität, flash-freeze die Aliquots in flüssigem Stickstoff oder inkubieren für 30 Sekunden in einer Methanol-Trockeneis-Bad vor der Lagerung. Seien Sie vorsichtig, um den direkten Hautkontakt mit dem Kühlkörper Reagenz zu vermeiden.
2. Immunadsorption von GR aus Zellcytosol
- Technischer Hinweis: Abbildung 2 zeigt eine schematische Übersicht über die Schritte 2-5 dieses Protokolls.
- Bereiten Sie eine Immunadsorption Mischung mit einem monoklonalen Immunglobulin G (IgG) Antikörper gegen das GR an den Rezeptor in Schritt 1 vorbereitet immunoadsorb angehoben. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren 100 ul aufgetauten GR-haltigen Cytosol, 200 ul TEGM Puffer (8 mM TES, 4 mM EDTA, 50 mM NaCl, 20 mM Molybdat, 10% (v / v) Glycerin, pH 7,6) , 100 ul einer 20% Protein A-Sepharose (PAS) Gülle (v / v, vorbereitet in TEGM Puffer) und 5 ug anti-GR monoklonaler IgG-Antikörper (zB BuGR2). Molybdat ist in der TEGM Puffer enthalten, um einen Beitrag zur Stabilisierung des GR-hsp90 Heterokomplex, was nützlich sein kann, um Assay endogenen Heterokomplex Steroid Bindungsaktivität 13.
- Anti-GR-Antikörper ist kommerziell erhältlich als gereinigtes Protein. Alternativ kann es durch Zugabe von 10 ul von anti-GR IgG-haltigen Aszites der Immunadsorption Mischung erhalten werden. Aszites wird durch Mäuse mit anti-GR Hybridomzellen (zB FIGR Hybridomzellen 14) injiziert produziert, und die ungefähre Antikörperkonzentration von Aszites gewonnen und in diesen Experimenten betrug 0,5 ug / ul, wie Bradford-Assay gemessen.
- Bereiten Sie eine negative Kontrollprobe mit GR-haltigen Cytosol, TEGM Puffer und PAS (wie oben beschrieben) und 5 ug eines IgG, die nicht erkennt GR, hsp90, oder andere molekulare Chaperon-Proteine (bezeichnet als "nichtimmunisierte" Antikörper).
- Aufgrund der relativ großen PAS Korngröße, verwenden Sie einen Schnitt P-200 Pipettenspitze bei der Übertragung von PAS aus der 20% Gülle Probenröhrchen. Cut Pipettenspitzen werden durch Aufschneiden 2-3 mm aus der Ende des kommerziell erhältlichen P-200 Tipps bereit, wodurch sich die Pipettenspitze Blende.
- Proben auf einer vertikalen rotierenden Rad und Inkubation für mindestens 2 Stunden mit konstanter Rotation. Die Proben könnenfür bis zu 8 Stunden ohne Verlust der Aktivität inkubiert werden.
- Zum Abschluss der Immunadsorption Inkubation entfernt ungebundenen Proteine aus den Antikörper-PAS Pellet ("immunopellet") durch Zentrifugation. Trennen Sie die Überstände von immunopellets durch Zentrifugation mit einer Kühlzentrifuge für 1 Minute bei 10.000 × g programmiert, und dann zweimal waschen mit 1 ml TEGM Puffer und Wirbel. Nach Zentrifugation und zwischen wäscht, den Überstand verwerfen zu vorsichtig, um nicht zu stören das Pellet.
- Entfernen Sie alle Überstand am Ende des zweiten waschen. Um zu gewährleisten, keines der Pellet versehentlich angesaugt wird, verwenden Sie eine gekräuselte P-200 Pipettenspitze für die endgültige Überstand Aspiration. Wellengitter Pipettenspitzen werden durch Abflachung handelsüblichen P-200 Tipps mit einer Pinzette vorbereitet.
3. Die Dissoziation von endogenen hsp90 von GR immunopellet ("Salt Stripping")
- Zu dem gewaschenen immunopellet in Schritt 2 vorbereitet, fügen Sie 355 ul TEG-Puffer (TEGM Puffer ohne Natriummolybdat) und 45 ul 5 M NaCl (final NaCl-Konzentration = 0,5 M).
- Proben auf einer vertikalen rotierenden Rad und Inkubation für 1,5 Stunden bei konstanter Rotation. Die Proben können bis zu 2 Stunden bebrütet werden, aber mehr Inkubationen können zu einer verminderten Protein Recovery und niedrigere funktionelle Aktivität führen.
- Entfernen ungebundenen Proteine aus dem immunopellet durch Zentrifugation. Spin Proben für 1 Minute bei 10.000 × g. Wash einmal mit 1 ml TEG-Puffer und einmal mit 1 ml 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,4.
- Entfernen Sie alle Überstand am Ende des zweiten waschen, darauf achten, daß die immunopellet stören, mit einer gekräuselten P-200 Pipettenspitze.
4. Rekonstitution der GR • hsp90 Heterokomplex mittels molekularer Chaperone, Cofaktoren und ATP
- Technischer Hinweis: Eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen kann durch die Einbeziehung zusätzlicher Proteine, Cofaktoren, Aktivatoren oder Inhibitoren von Interesse in der Rekonstitution Mischung hergestellt unten getestet werden. Gesamtvolumen der Rekonstitution Mischungen sollte <120 ul werden.
- Jedes Salz-abgestreift immunopellet in Schritt 3 vorbereitet, fügen Sie eine Rekonstitution Mischung mit 50 ul einer molekularen Chaperon Quelle und 5 ul einer ATP-erzeugende System (10 mM HEPES, 50 mM ATP, 250 mM Kreatinphosphat, 20 mM Magnesiumacetat , 100 U / ml Kreatinphosphokinase, pH 7,4).
- Rekonstitution Reaktionen können durch Ergänzung der Rekonstitution Mischung mit 50 ul HKD-Puffer (10 mM HEPES, 100 mM KCl, 5 mM Dithiothreitol (DTT), pH 7,4) und eine zusätzliche 5 ul der ATP-erzeugenden Systems erhöht werden. Dieser Schritt kann entfallen, wenn genügend Rekonstitution und Steroid-Bindung beobachtet werden. KCl erhöht hsp70 ATPase-Aktivität und DTT schützt Cystein-enthaltenden Proteine vor Oxidation 9.
- Eine empfohlene Chaperon Quelle ist im Handel erhältlich Kaninchen-Retikulozyten-Lysat. Individuelle molekulare Chaperone von Retikulozyten-Lysat gereinigt oder rekombinant exprimiert (zB 15 ug hsp90, 15 ug hsp70, 0,6 pg Hop, 6 ug p23, und 0,125 pg Hsp40 in HKD Puffer) können ebenfalls verwendet werden.
- Inkubieren Proben in einem 30 ° C Wasserbad für genau 20 Minuten. Flick Röhren alle 1-2 Minuten, um sanft zu stören das Pellet und mischen die Wiederherstellung Lösung.
- 1 ml TEGM Puffer, vortexen und zentrifugieren bei 10.000 xg für 1 Minute. Überstand entfernen und entsorgen Sie darauf achten, daß das Pellet stören. Wiederholen Sie dies für insgesamt drei Wäschen. Entfernen Sie alle Überstand am Ende der letzten Wäsche mit einer gekräuselten P-200 Pipettenspitze.
5. Die Analyse der rekonstituierten Protein-Komplexen und Liganden-Bindungsaktivität
- Proteine in der rekonstituierten immunopellet kann durch herkömmliche denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), Mikrofluidik-Elektrophorese (zB Bio-Rad Experion) und Western-Blot (Abb. 3) identifiziert werden. Technischer Hinweis: Ausgezeichnete Protokolle beschreiben SDS-PAGE 15 und Western-Blot-16 sind derzeit verfügbar, mit freundlicher Genehmigung von anderen Forschern.
- Dann werden 50 ul der SDS-PAGE-Probenpuffer mit β-Mercaptoethanol und Wirbel. Spezifische Probenpuffer Rezepte variieren. Wählen Sie eine auf der Grundlage der Empfehlung des Herstellers der Elektrophorese-System eingesetzt werden.
- Inkubieren für 5 Minuten in ein kochendes Wasserbad oder 100 ° C elektronische Heizblock.
- Zentrifugation bei 10.000 × g für 1 Minute. Die immunoadsorbing Antikörper, GR, und Proteine im Komplex mit GR werden voneinander trennen und in die Probenpuffer Überstand.
- Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Reaktionsgefäß mit einer gekräuselten Spitze P-200 Pipettenspitze. Verwerfen des Pellets. Die Probe wird nun für die Analyse mit handelsüblichen SDS-PAGE-Elektrophorese oder mikrofluidischen Systemen vorbereitet. Komplette entweder Technik fach den Anweisungen des Herstellers.
- Western-Blot-Analyse nach SDS-PAGE ermöglicht definitive Identifizierung der immunoadsorbed GR und der molekularen Chaperone im Komplex mit dem GR nach der Rekonstitution Inkubation. Verwenden Sie monoklonalen primären Antikörper gegen GR (BuGR2), hsp90 (AC88) angehoben, hsp70 (N27F3-4) und Co-Chaperon-Proteine zu den wichtigsten Komponenten der GR • hsp90-Protein-Komplex zu erkennen.
- Funktionelle Aktivierung des Salz-abgestreift GR Nach Wiederherstellung der GR • hsp90-Protein-Komplex durch Testen Steroid Bindungsaktivität mit einem [3 H] Steroid (Abb. 4) identifiziert werden können. Für den Rest des Protokolls folgen notwendigen Vorkehrungen für den sicheren Umgang mit Tritium-Proben und Abfällen.
- Um die rekonstituierte immunopellet, fügen 47,5 ul HEM-Puffer und 2,5 ul 2 uM [3 H] Dexamethason (final Steroid-Konzentration = 100 nM).
- Vorsichtig mischen das Pellet wird vorsichtig, um die Menge der Probe verschoben, um die Wand der Mikrozentrifugenröhrchen zu minimieren.
- Inkubieren über Nacht auf Eis. Es ist nicht notwendig zu drehen oder zu mischen Probenröhrchen während dieser Inkubationszeit.
- 1 ml TEGM Puffer, vorsichtig mischen und zentrifugieren bei 10.000 xg für 1 Minute. Überstand verwerfen, achtsam es enthält ungebundene [3 H] Steroid. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 Waschgänge mit TEGM Puffer.
- Entfernen Sie alle Überstand am Ende der letzten Wäsche mit einer gekräuselten P-200 Pipettenspitze. Das Pellet enthält GR, hsp90 und andere molekulare Chaperone im Komplex mit dem GR und der [3 H] Steroid speziell an den Rezeptor gebunden. Die unspezifische Bindung kann durch die Aufnahme 1000-fachen Überschuss nicht-Tritium-Dexamethason in der Inkubation über Nacht Mischung berechnet werden. Als alternative negative Kontrolle, fügte der anti-GR immunoadsorbing Antikörper in Schritt 2.2 kann ersetzt werden durch eine nicht-GR-immunoadsorbing Antikörper (NI).
- Hängen Sie das gewaschene immunopellets in 200 ul TEGM Puffer und Transfer bis 10 ml Szintillationsgefäße mit einem Schnitt P-200 Pipettenspitze.
- Fügen Sie 4,8 ml Szintillations-Cocktail auf den Fläschchen und vortexen.
- Der Betrag von [3 H] Steroid Bindung an die rekonstituierte GR • hsp90-Protein-Komplex kann untersucht mit Hilfe von flüssigem Szintillationsspektrometrie werden.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Vertreter SDS-PAGE und Western-Blot-Daten sind in Abbildung 3 dargestellt. Die endogenen GR • hsp90 Heterokomplex aus Zellcytosol mit anti-GR-Antikörper und einzelne Proteine, die Zusammenarbeit immunoadsorb mit dem GR visualisiert durch Coomassie-Färbung (Abb. 3A) sind immunoadsorbed. Die Bestätigung von Protein Identität jeder Komponente der immunopellet bei jedem Schritt in der Rekonstitution Assay kann durch SDS-PAGE Berechnung von Molekulargewicht und Western-Blot mit monoklonalen Antikörpern gegen das Protein von Interesse geweckt werden.
Rekonstituierte GR • hsp90 Heterokomplexen werden anhand Experion mikrofluidischen Elektrophorese-Daten (Abb. 3C und 3D) und Western-Blot-Analyse (Abb. 3B). Die Spezifität der GR Immunadsorption ist durch Austausch des immunoadsorbing anti-GR Antikörper mit einem nichtimmunisierte Antikörper (Abb. 3C, NI IgG lanes) bestätigt. Auch wenn übermäßige Mengen von nichtimmunisierte Antikörper verwendet werden, sind keine GR oder molekulare Chaperone immunpräzipitiert (vgl. in Abb.. 3C, die GR, hsp90 und hsp70 Proteinbanden in der anti-GR Immunadsorption Gassen mit dem Mangel an Band in den beobachteten NI IgG lanes). Ebenso ist es möglich, die Dissoziation von Hsp90 und andere Chaperon-Proteine aus dem Salz-abgestreift GR durch Western-Blot-Analyse (Abb. 3B) der entkleidet und rekonstituierte immunopellets bestätigen. Die schwere Kette des Antikörpers immunoadsorbing (HC) wird sowohl durch Coomassie-Färbung und Western-Blot nachweisbar, und es dient dazu, gleich große immunopellets werden visualisiert in jeder Spur zu bestätigen.
Steroid Bindungsaktivität des immunoadsorbed GR kann für alle getesteten Bedingungen getestet werden, und Vertreter Steroid Binden von Daten sind in Abbildung 4 dargestellt. Endogene GR • hsp90 Heterokomplexen sind immunoadsorbed, Salz-gestrippt und neu konstituiert. Verwenden Sie entweder Retikulozytenlysat oder gereinigte Proteine, Steroid-bindende Aktivität der rekonstituierten GR • hsp90 Heterokomplex typischerweise wieder 75-100% der endogenen GR • hsp90 bindende Aktivität. Ähnlich wie bei der Elektrophorese-Daten kann eine nichtimmunisierte Antikörper (NI) an die Stelle der anti-GR-Antikörper (I) verwendet werden, um als negative Kontrolle dienen und als Maß für die unspezifische [3 H] Steroid verbindlich.
Abbildung 1. Modell GR • hsp90 Heterokomplex Montage und GR Steroid Bindungsschlucht Öffnung. Die hsp90/hsp70-based Chaperon Maschinerie wandelt die GR-Ligand-bindende Domäne von einem folded Konformation, in der die Steroid-Bindungsschlucht geschlossen und ist nicht zugänglich Hormon zu einem offenen Spalt Konformation, auf die zugegriffen (dargestellt durch den heterocyclischen Steroid-Symbol) werden kann. Das Chaperon Maschinerie in der Zelle vormontiert und wird spontan bilden, wenn gereinigt hsp90, hsp70 und Hop sind in Lösung gemischt (Reaktion 1). Hop enthält eine 34 Aminosäuren tetratricopeptide wiederholen (TPR) Domain (dargestellt als dunkler Halbmond), und später während der Heterokomplex Reifungsprozess durch eine TPR-Domäne-haltigen Immunophilin Protein ersetzt. Der Maschinenpark wird das Steroid verbindlich in einem ATP-und K +-abhängigen Weise gespalten, woraufhin Hop und die meisten der hsp70 und Hsp40 letztlich verlassen den Komplex (dargestellt als gestrichelte Symbol). Mechanistisch interagiert hsp70 mit dem GR vor dem hsp90 und Primzahlen der Rezeptor für hsp90 und anschließender Spalt öffnen. Experimentell sind Steroid verbindlich und GR Spalt öffnen erhöht werden, wenn hsp90 und hsp70 gleichzeitig anwesend sind. Die Heterokomplex wird durch Eingabe der hsp90 Co-Chaperon p23, die hsp90 pflegt in einem ATP-gebundenen Konformation stabilisiert. Nach der Abfahrt von Hop, kann ein hohes Molekulargewicht Immunophilin (IMM) binden hsp90 und bildet die letzte Heterokomplex, wie es aus den Zellen gewonnen wird. Angepasst von Pratt und Toft 1.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Schritte 2-5 dieses Protokolls. Der GR ist aus Zellcytosol mit einem monoklonalen Antikörper gegen den GR (FIGR) verpflichtet, ein Pellet aus Protein A-Sepharose angehoben immunoadsorbed. Hsp90 und andere Chaperon-Proteine in der endogenen GR • hsp90 Heterokomplex sind mit dem GR Zusammenarbeit immunoadsorbed, und der GR ist in der Lage, Steroid-binden. Hsp90 ist losgelöst von GR mit einem milden Salz-Behandlung, die so genannte Salz-Stripping (Str). Das Steroid Bindung der Salz-abgestreift GR Spalt schließt, so dass es nicht in der Lage, Steroid-binden. Intermediate GR • hsp90 Heterokomplexen mit hsp70, Hsp40 und Hop, bindefähigen Steroid sind, können wiederhergestellt (Recon) durch Inkubation der Salz-abgestreift GR mit gereinigten Proteinen oder Retikulozytenlysat (Retic Lysat) und Cofaktoren werden. Das Steroid-Bindungsaktivität und immunopellet Proteingehalt jeder Schritt kann über Nacht [3 H] Steroid Inkubation und Western-Blot bzw. identifiziert werden.
Abbildung 3. Elektrophoretische Protein-Analyse von immunoadsorbed Komplexe. A, SDS-PAGE der rekonstituierten GR • hsp90 Heterokomplex abgebildet mit herkömmlichen Elektrophorese-System von Elektrotransfer und Coomassie-Färbung. Neben GR, hsp90 und hsp70, werden die schwere Kette (HC) und der leichten Kette (LC) der Antikörper sichtbar gemacht. Migration der Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind auf der linken Seite angegeben. B, Western-Blot von immunopellets mit Salz-abgestreift GR (Str) und rekonstituierte GR • hsp90 Heterokomplex (Recon). C, virtuelle Gel rekonstituierter GR • hsp90 Heterokomplex erzeugt mit Hilfe eines Experion mikrofluidischen Elektrophorese-System. Zwei verschiedene Konzentrationen eines nichtimmunisierte (NI IgG) und Immunsystem (anti-GR) immunoadsorbing Antikörper enthalten sind. NI IgGs dienen als negative Kontrollen. D, Elektropherogramm rekonstituierte GR • hsp90 Heterokomplex von Experion mikrofluidischen Elektrophorese Probe in der dritten Spur der Platte B. Vorteile von mikrofluidischen Elektrophorese sind die Voraussetzung für kleinere Probenvolumina gezeigt erhalten, verringert Liquid-Handling-und post-run Bereinigung, bessere Quantifizierung und wesentlich kürzere Probe läuft.
Abbildung 4. Steroid-bindende Aktivität von immunopellets folgenden Immunadsorption von endogenen GR (Enodg), Salz-abgestreift GR (Str) und rekonstituierte GR • hsp90 Heterokomplex (Recon). Neben immunoadsorbing der GR mit einem monoklonalen anti-GR immunoadsorbing Antikörper (I) wurden negative Kontrollproben für jede Bedingung hergestellt unter Verwendung eines nichtimmunisierte Immunglobulin (NI).
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Discussion
Die oben beschriebenen Test lässt sich an einer Vielzahl von Erkrankungen des Chaperon Aktionen der hsp90/hsp70-based Chaperon Maschinen sowie GR Steroid verbindlich zu testen. Es ist eine Abwandlung der zuvor beschriebenen Verfahren 4,8,9,17 und ist so konzipiert, um die Vorteile der jüngsten Fortschritte in der Elektrophorese-Technik zu nehmen und werden von einem breiteren Forschungsgemeinschaft. Weitere Cofaktoren oder Proteine von Interesse kann der GR hinzugefügt werden • hsp90 Heterokomplex Rekonstitution Mischung in Schritt 4 des Protokolls beschrieben, um die Auswirkungen auf die Steroid-bindenden, Heterokomplex Protein-Protein-Interaktionen, und Co-Faktor Anforderungen zu beachten. Zum Beispiel können die Auswirkungen von Ischämie-Reperfusion auf hsp90-Funktion mit der Zugabe von steigenden Konzentrationen eines reaktiven Sauerstoff-Spezies modelliert werden. Gereinigte Proteine mit einem bestimmten Merkmal (zB acetylierte hsp90) oder potenziellen HSP90-Inhibitoren (z. B. neuartige Geldanamycin-Analoga) können hinzugefügt werden, damit ihre Auswirkungen auf die Steroid-bindenden und Heterokomplex Bildung bestimmt werden.
Down-stream-Assays anders als Elektrophorese, können Western-Blot und Steroid-Bindungs-Assays eingesetzt werden. Zum Beispiel haben immunpräzipitiert Multiproteinkomplexen mittels Durchflusszytometrie mit erheblichen Erfolg 18,19 analysiert worden. Die immunoadsorbed GR • hsp90-Komplexe können auch für hsp90/hsp70 Nukleotid Zustand getestet werden oder visualisiert Rasterkraftmikroskopie 17. Hsp90-Proteine mit Ausnahme der GR verwendet werden (z. B. chaperoning Checkpoint-Kinase I (Chk1) 20), und wegweisende Forschung wurde durchgeführt mit Variationen dieses Protokoll mit dem Östrogen-Rezeptor-, Progesteron-Rezeptor und Src 1,13,21.
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Disclosures
Wählen Elektrophorese Reagenzien und Bildanalyse-Software wurden von Bio-Rad zur Verfügung gestellt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health gewähren GM086822, Hope Heart Institute Basic Sciences ausgezeichnet, und die MJ Murdock Charitable Trust Hochschule Science Research-Programm finanziert. Wählen Elektrophorese Reagenzien und Bildanalyse-Software wurden großzügigerweise von Bio-Rad zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
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