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Biology

类固醇受体的生化重建•Hsp90的蛋白质复合物和配体激活绑定

doi: 10.3791/3059 Published: September 21, 2011

Summary

一个

Abstract

HSP90是一个重要和非常丰富,已发现调节超过150个的真核细胞信号蛋白,包括转录因子(如核受体,P53),并参与细胞周期蛋白激酶(如SRC,英国皇家空军,Akt激酶)的分子伴侣蛋白,肿瘤的发生,细胞凋亡和多种真核细胞信号转导通路1,2。许多这些“客户”HSP90蛋白,类固醇受体大会•HSP90复合物是最好的定义( 图1)。我们在座的适应性强的糖皮质激素受体 ​​(GR)的免疫测定体外GR•HSP90重组的方法,可随时用来探测HSP90真核细胞的功能活动,HSP90介导的类固醇激素受体 ​​配体的结合,以及分子伴侣辅助因子的要求。例如,此法可用于测试HSP90的辅助因子的要求和加入外源性化合物的重组进程的影响。

遗传资源已经为研究HSP90一个特别有用的系统,必须绑定到HSP90,因为受体有一个开放的配体结合裂访问类固醇 3 。内源性的,unliganded的GR非共价的约束,以HSP90的哺乳动物细胞的细胞质中。如发现内源性GR•HSP90 heterocomplex,GR配体结合裂,是开放的和有约束力的类固醇的。如果从GR HSP90不赞成或如果其功能受到抑制,受体是无法绑定类固醇和需要重组的GR•HSP90 heterocomplex的结合活性类固醇之前恢复 4 。遗传资源,可以从细胞细胞质使用单克隆抗体免疫沉淀,如HSP90蛋白复合物,以遗传资源,可以通过免疫印迹检测。免疫沉淀的GR结合活性的类固醇,可以由孵化与[3H]类固醇immunopellet 。

以前的实验已经证明HSP90介导的GR配体裂约束力的开放需要HSP70,第二个分子伴侣,也为真核细胞的活力至关重要。 HSP90和HSP70的生化活性催化合作伴侣蛋白合,hsp40,和P23 5 。一个多蛋白的伴侣机械HSP90,HSP70,合,和hsp40是在真核细胞的细胞质内源性目前,网织红细胞裂解液提供了一个伴侣,含有丰富的蛋白质来源6。

提出的方法,GR是immunoadsorbed从细胞细胞质和内源性hsp90/hsp70伴侣用温和的盐条件下的机械剥离。盐剥离的GR然后孵育•HSP90 heterocomplex和类固醇的结合活性激活7,网织红细胞裂解液,三磷酸腺苷和K +,这在重组的GR结果。可以利用这种方法来测试各种伴侣的辅助因子,新的蛋白质,和实验HSP90或GR抑制剂的影响,以确定其HSP90介导的类固醇具有约束力8-11的功能意义。

Protocol

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1。制备细胞细胞质中含有功能的GR

  1. 技术说明:所有的缓冲区应冷藏,此协议,包括离心和孵化,每一步应在冰上或在4 ° C,除非另有说明。低温是必不可少的,以防止GR和蛋白质复合物的降解。
  2. 使用冷冻离心机,取得了〜1-5毫升颗粒细胞功能的GR表达了高浓度。在遗传资源丰富的细胞来源的例子包括:小鼠成纤维L929细胞,它表达的内源性遗传资源的高浓度,并昆虫重组GR杆状病毒(如p2Bac 经理杆状病毒12)已被感染的细胞。大约15-20毫升包装细胞获得每昆虫杆状病毒细胞培养升。细胞应呈几何级数增长,前收获。在5000 × g离心5分钟的细胞悬液。
  3. 汉克斯“缓冲盐溶液15毫升,冲洗细胞沉淀三次。清洗,轻轻悬浮5分钟,随后在5000离心沉淀× G。最后一次洗涤,彻底去除上清。
  4. 准备7.5毫升含HEM的缓冲液(10 mM的HEPES,1毫米EDTA,20毫米钼酸钠,pH值7.4),1毫米苯甲基磺酰氟(PMSF),和3完成迷你蛋白酶抑制剂的地面片的缓冲一个同质化。 PMSF和完整的小片在随后的步骤防止发生水解。完整的迷你片,可以很容易地地面到细粉用迫击炮和杵。添加1.5卷同质缓冲细胞沉淀。
  5. 破裂Dounce同质化(50杆)或冻结/解冻(3次)技术的细胞。 Dounce同质化可能维持改善内源性的GR•HSP90蛋白复合物,并更快地完成。冻结/解冻提供研究人员一个机会,暂停在这一步的协议,并继续在稍后的时间。 Dounce同质化应与冰桶匀浆,以防止蛋白质的降解。冻结/解冻,可完成冻结的离心管中,含有颗粒同质化缓冲液的细胞用液氮,干冰或-20 ° C孵化,在30℃水浴解冻。
  6. 通过超速离心分离从破裂的细胞颗粒物质的GR含有细胞质。在100,000 × g匀浆转移耐用的超速离心机管,对群众的平衡管和离心30分钟。
  7. 取出500μL分装在长期储存的1.5毫升离心管,在-20细胞质(上清液)和存储° C。要保留的最大的功能GR活动,闪存冻结30秒甲醇干冰浴前存储在液态氮或孵化分装。一定要小心,以避免皮肤直接接触冷却剂。

2。从细胞细胞质遗传免疫吸附

  1. 技术说明:图2提供了这个协议的步骤2-5的示意图。
  2. 准备一个包含immunoadsorb在第1步准备的受体对GR提出一个单克隆免疫球蛋白(IgG)抗体的免疫吸附混合物。在1.5 ml离心管中,结合解冻的GR - 100μL含有细胞质中,200μLTEGM缓冲区(8毫米的工商业污水附加费,4毫米EDTA,50毫米的NaCl,20毫米的钼,10%(V / V)甘油,pH值7.6) 100μL20%的蛋白质A -琼脂糖凝胶(PAS)浆(V / V,准备在TEGM缓冲区),5微克抗- GR的单克隆抗体(如BuGR2)。钼是包括在TEGM缓冲区,以帮助稳定GR - HSP90 heterocomplex,这可能是有用的,以测定的内源性heterocomplex类固醇结合活动 13 。
    1. 反GR抗体纯化蛋白上市。另外,它可能会取得反GR的含有IgG的腹水免疫吸附混合物中加入10μL。腹水是由小鼠注射抗- GR杂交瘤细胞(如FiGR杂交瘤细胞14),并获得腹水和在这些实验中使用的是近似的抗体浓度为0.5μg/μL,Bradford法测定。
    2. 准备一个阴性对照样品,使用GR - 含有细胞质中,TEGM缓冲区,和首席助理秘书长(如上所述),一个IgG和5微克不承认的GR,HSP90,或其他分子伴侣蛋白(简称为“非免疫”抗体)。
    3. 由于比较大的PAS珠子大小,使用切割时的P - 200吸管尖转移的20%浆PAS样品管。切吸管提示准备切片2-3毫米市售的P - 200提示结束,从而增加了吸管尖光圈。
  3. 将样品在垂直旋转的轮子和2小时为一个不断旋转的最低孵化。样品可能长达8小时的孵育,而不失去活性。
  4. 在免疫吸附孵化结束,去除未结合的蛋白质抗体考绩颗粒(“immunopellet”)离心。从immunopellets分开使用一个冷冻离心机1分钟编程10,000 × G离心的上清液,然后用1 ml TEGM缓冲区和涡流清洗两次。经过离心和洗涤之间,弃上清,谨慎,不打扰颗粒。
    1. 删除所有在第二洗的结论上清。为了确保没有颗粒不经意地吸气,用压接的P - 200吸管尖,最终上清愿望。轧花吸管提示准备压扁市售的P - 200的提示使用镊子。

3。从遗传资源immunopellet内源性HSP90分解(“盐剥离”)

  1. 要洗immunopellet准备在第2步,添加355μL甘醇缓冲液(TEGM没有钼酸钠缓冲液)和45μL5 M氯化钠(NaCl浓度最终= 0.5米)。
  2. 将样品在垂直旋转的轮子和不断旋转的1.5小时的孵化。样品可以孵育长达2个小时,但是,较长的孵化,可能会导致减少蛋白质的恢复和功能活性较低。
  3. 取出离心的immunopellet未结合的蛋白质。 1分钟,在10000 × G.旋转样品洗一次1毫升甘醇缓冲​​区,并一度以1毫升10 mM的HEPES缓冲液,pH值7.4。
  4. 删除所有在第二洗的结论上清,小心,不要去打扰immunopellet,使用一个卷曲的P - 200吸管尖。

4。重组的GR•HSP90 heterocomplex使用分子伴侣,辅助因子,与ATP

  1. 技术说明:无​​数的实验条件,可以测试到准备下面的重组混合物,包括额外的蛋白质,辅助因子,激活剂,或利益抑制剂。重组混合物的总体积应<120μL。
  2. 每个盐剥离immunopellet准备在第3步,添加一个重建的混合物,含有50μL分子伴侣源和5μL一个ATP生成系统(10 mM的HEPES 50 mM的ATP,磷酸肌酸250毫米,20毫米醋酸镁100 U / ml的肌酸磷酸激酶,pH值7.4)。
    1. 重整反应,可能会增加补充重组混合物50μL港币缓冲液(10 mM的HEPES,氯化钾100毫米,5毫米二硫苏糖醇(DTT),pH值7.4)和ATP生成系统的一个额外的5μL。如果观察充足的重组和类固醇具有约束力,这一步可以省略。氯化钾增加HSP70的ATP酶活性及数码地面电视保护半胱氨酸含蛋白质氧化 9 。
    2. 一个推荐的分子伴侣来源是市售的兔网织红细胞裂解物。个别分子伴侣从网织红细胞裂解液纯化或重组表达(如15微克HSP90,HSP70 15微克,0.6微克合,P23 6微克和0.125微克港元缓冲区hsp40),也可使用。
  3. 在30℃水浴整整20分钟中孵育样品。弗里克管,以每1-2分钟,轻轻扰乱颗粒混合重组解决方案。
  4. 1分钟,加入1毫升TEGM缓冲区,旋涡,在10,000和离心机× G。小心,不要去打扰颗粒去除上清液并丢弃。共有3个洗重复。在缔结最终使用的P - 200压接吸管尖洗,彻底清除所有上清。

5。重组蛋白复合物与配体结合活性分析

  1. 在重组immunopellet中的蛋白质可以识别常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE),微流控电泳(如Bio - Rad公司的Experion),和免疫印迹( 3 )。技术说明:优秀的协议, 描述 15 SDS - PAGE电泳和免疫印迹 16目前,其他调查员的礼貌。
    1. 添加50μL的SDS - PAGE样品缓冲液含有β-巯基乙醇和涡。特定的样品缓冲液配方有所不同。被聘用的电泳系统的制造商建议的基础上,选择之一。
    2. 孵育5分钟,在沸水浴或100 ° C电子加热块。
    3. 在10,000 × g离心1分钟。 immunoadsorbing抗体,GR蛋白复合物遗传资源将脱离彼此释放到样品缓冲液上清中。
    4. 将上清转移至一个新的离心管,用吸管尖的P - 200压接尖。弃去沉淀。正准备用市售的SDS - PAGE或微流控电泳系统分析样品。完成两种技术following制造商的指示。
    5. Western blot分析以下的SDS - PAGE可为最终鉴定immunoadsorbed遗传和分子伴侣的GR复合重组孵化。使用对GR(BuGR2),HSP90(AC88)提出的单克隆抗体,HSP70(N27F3 4)和合作伴侣蛋白检测GR•HSP90蛋白复合物的主要成分。
  2. •HSP90蛋白复合物,可以通过化验使用类固醇的结合活性[3H] 类固醇(图 4)确定遗传资源的重组后,盐剥离的GR功能激活。对于该协议的其余部分,遵循必要的预防措施,安全处理氚的样品和废物。
    1. 重组后immunopellet,添加47.5μLHEM的缓冲区2微米和2.5μL[3H]地塞米松(最后的类固醇浓度= 100纳米) 。
    2. 轻轻地混合沉淀小心,尽量减少流离失所的样品量的离心管的墙。
    3. 在冰上孵育过夜。它是没有必要的旋转或在此孵化混合样品管的。
    4. 添加1毫升TEGM缓冲液,轻轻混匀,在10,000和离心机× G为1分钟。弃上清,被铭记,它包含未绑定的[3 H]类固醇。重复共3 TEGM缓冲液洗。
    5. 在缔结最终使用的P - 200压接吸管尖洗,彻底清除所有上清。颗粒包含的GR,HSP90和其他分子伴侣复合物的GR,[H]类固醇受体特异性结合。非特异性结合,可以计算,包括1000倍的超额非氚在地塞米松孵育过夜混合物。作为替代阴性对照,反GR immunoadsorbing抗体可能会被替换在步骤2.2中添加非GR - immunoadsorbing(NI)的抗体。
    6. 挂起200μLTEGM缓冲区,并转移至10 ml闪烁瓶使用的P - 200吸管尖切洗immunopellets。
    7. 加入4.8毫升闪烁鸡尾酒瓶和涡。
    8. [3H]类固醇结合到重组后的GR金额•HSP90蛋白复合物,可以使用液体闪烁光谱法测定。

6。代表性的成果:

代表SDS - PAGE和免疫印迹数据列在图3。内源性的GR•HSP90 heterocomplex immunoadsorbed使用反GR抗体和合作与GR immunoadsorb考马斯染色(图3A)显示的个别蛋白质从细胞的细胞质。蛋白质在重组实验的任何步骤的immunopellet任何组件的身份确认,可经SDS - PAGE计算分子量和使用提出对感兴趣的蛋白质的单克隆抗体免疫印迹。

冲调的GR•HSP90 heterocomplexes是使用的Experion微流体电泳数据(图3C和3D)和免疫印迹分析(图3B)。确认的GR免疫吸附特异性与非免疫抗体(图3C,NI IgG抗体车道)取代immunoadsorbing抗体抗- GR。即使过量使用非免疫抗体免疫沉淀,没有遗传或分子伴侣(参见图3c,GR,HSP90,HSP70蛋白带目前所观察到的带缺乏反GR免疫吸附车道NI IgG的车道)。同样,它可能证实了HSP90的分离和其他伴侣蛋白,盐剥离的剥离和重组immunopellets克免疫印迹分析(图3B)。考马斯染色和免疫印迹immunoadsorbing抗体的重链(HC)的检测,它是为了确认平等的大小immunopellets在每个泳道显示。

immunoadsorbed的GR结合活性的类固醇可以检测所有的测试条件,和有代表性的类固醇数据绑定在图4。内源性的GR•HSP90 heterocomplexes immunoadsorbed,盐剥离,重组。使用这两种网织红细胞裂解物或纯化的蛋白,重组的GR结合活性的类固醇•HSP90 heterocomplex通常返回的内源性GR•HSP90结合活性水平的75-100%。电泳数据相似,可能是一个非免疫抗体(NI)的反GR抗体(一)地方,以服务为阴性对照,并作为衡量非特异性[3H]类固醇具有约束力。

图1
图1。GR•HSP90 heterocomplex大会和遗传资源类固醇结合裂开放模型。 hsp90/hsp70-based伴​​侣机械转换GR配体结合域从一个FOLDED的构象在类固醇结合裂是封闭的,而不是访问激素可以访问(杂环类固醇图标所示)一个开放的裂构象。伴侣机器预装在细胞和纯化HSP90,HSP70时,会自发形成,合溶液混合(反应1)。合包含34氨基酸tetratricopeptide重复(TPR)域(作为一个黑暗的新月所示),是后来在一个TPR域包含immunophilin蛋白heterocomplex成熟过程中所取代。机械打开类固醇结合的ATP和K +依赖性裂,后合和最hsp70和hsp40最终离开复杂的(图标为虚线所示)。机械,HSP70与GR相互作用之前HSP90和HSP90的受体素数的和随后裂开放。实验中,类固醇具有约束力和GR裂开放增加,如果HSP90和HSP70同时存在。 heterocomplex是稳定的HSP90合作伴侣P23,保持在一个ATP约束构型HSP90的条目。一个超高分子量immunophilin(IMM)合退出后,可以绑定HSP90,形成最终heterocomplex的,因为它是从细胞恢复。改编自普拉特和Toft 1。

图2
图(2)本协议的步骤2-5的示意图。 GR是immunoadsorbed使用绑定的蛋白A琼脂糖凝胶颗粒的GR(FiGR)提出的一种单克隆抗体,对细胞的细胞质。 HSP90和其他伴侣蛋白存在于内源性的GR•HSP90 heterocomplex与GR合作immunoadsorbed,和GR是能够绑定到类固醇。 HSP90是脱离使用温和的盐处理盐剥离(STR),简称GR。类固醇具有约束力的盐剥离的GR裂闭合,使得它无法绑定到类固醇。中级GR•HSP90 heterocomplexes含有HSP70,hsp40,和跳,这是能够约束力的类固醇,可以重组,孵化与纯化蛋白质或网织红细胞裂解液(Retic裂解液)和辅助因子的盐剥离的GR(侦察)。类固醇的结合活性和immunopellet蛋白质含量每一步可以过夜[H]的类固醇孵化和免疫印迹分别确定。

图3
图3。immunoadsorbed复合物电泳的蛋白质分析。一,重组的遗传资源的SDS - PAGE•HSP90 heterocomplex影像使用传统的电泳系统electrotransfer和考马斯染色。此外GR,HSP90和HSP70,重链(HC)和轻链抗体(立法会)的可视化。分子量标记(kDa的表达)的迁移,是显示在左侧。 B,含有盐剥克(STR)和重组GR•HSP90 heterocomplex(侦察)immunopellets免疫印迹。 ,重组遗传资源的虚拟凝胶•HSP90 heterocomplex使用的Experion微流体电泳系统生成的。包括两个不同浓度的一个非免疫(NI IgG抗体),免疫(抗- GR)immunoadsorbing抗体。 NI的IgG为阴性对照。研发,电泳重组的GR•HSP90的Experion微流体电泳显示面板B.微流控电泳的优点,包括较小的样本量的要求第三线的样品获得的heterocomplex,降低液体处理和运行后清理,提高了量化,并大幅较短的样品运行。

图4
图4。类固醇结合活性,免疫吸附内源性的GR(Enodg),盐剥离的GR(STR)immunopellets和重组的GR•HSP90 heterocomplex(侦察)。此外,immunoadsorbing单克隆抗- GR immunoadsorbing抗体(一)GR,每个条件的阴性对照样品,使用非免疫球蛋白(NI)的准备。

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Discussion

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上文所述的检测可以适应测试无数影响hsp90/hsp70-based伴​​侣机械伴侣行动以及GR类固醇具有约束力的条件。这是以前报道的方法 4,8,9,17的修改,旨在充分利用电泳技术的最新进展,并接触到更广泛的研究界。可以添加额外的辅助因子或蛋白质的利益,在GR•HSP90 heterocomplex重组的混合物,在本议定书第4步中所述,以观察对类固醇的约束力,heterocomplex蛋白质相互作用,并共同因素的要求影响。例如,缺血再灌注的影响HSP90功能可以模拟与活性氧物种的浓度的增加除了。可加入具有特定功能(如乙酰化HSP90)或潜在的Hsp90抑制剂(如新的格尔德霉素类似物)的纯化蛋白质,以便确定的类固醇的约束力和heterocomplex形成的影响。

下游不同的检测比电泳,免疫印迹和类固醇结合实验也可聘用。例如,免疫沉淀多蛋白复合物进行了分析,通过流式细胞仪检测有大量成功18,19。 immunoadsorbed的GR•HSP90复合物也可能被检测hsp90/hsp70核苷酸状态或可视化使用原子力显微镜17。 Hsp90的客户端的GR蛋白可用于(例如chaperoning检查点激酶(CHK1)20),并已进行了开创性研究,使用此协议的变化与雌激素受体 ​​,孕激素受体 ​​, SRC 1,13,21。

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Disclosures

选择电泳试剂和图像分析软件是由Bio - Rad公司提供的。

Acknowledgments

这项工作是由国家健康授予GM086822,希望心脏研究所的基础科学奖,兆焦耳默多克慈善信托基金科学学院研究计划研究院资助。选择电泳试剂和图像分析软件Bio - Rad公司提供的慷慨。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 insect cells Invitrogen for baculovirus expression of recombinant mouse GR
L929 cells ATCC CRL-2173 for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression)
FiGR hybridoma cells ATCC CRL-2173 for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody)
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free Roche Group 11836170001
protein A-Sepharose Sigma-Aldrich P3391
rabbit reticulocyte lysate Green Hectares (Oregon, WI) rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery
creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C3755 for ATP-regenerating system
phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936 for ATP-regenerating system
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) Pierce, Thermo Scientific MA1-510 used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) Enzo Life Sciences ADI-SPA-830 used as primary antibody in western blotting
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) Enzo Life Sciences ADI-SPA-820 used as primary antibody in western blotting
IgG from mouse serum Sigma-Aldrich 038K7690 used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate Sigma-Aldrich A4416 used as secondary antibody in western blotting
Experion microfluidic electrophoresis system Bio-Rad 7007001 alternative to conventional SDS-PAGE
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone PerkinElmer, Inc. NET1192001MC follow safety precautions

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References

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类固醇受体的生化重建•Hsp90的蛋白质复合物和配体激活绑定
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Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).More

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