Summary
一个
Abstract
HSP90是一个重要和非常丰富，已发现调节超过150个的真核细胞信号蛋白，包括转录因子（如核受体，P53），并参与细胞周期蛋白激酶（如SRC，英国皇家空军，Akt激酶）的分子伴侣蛋白，肿瘤的发生，细胞凋亡和多种真核细胞信号转导通路1,2。许多这些“客户”HSP90蛋白，类固醇受体大会•HSP90复合物是最好的定义（ 图1）。我们在座的适应性强的糖皮质激素受体 （GR）的免疫测定和体外GR•HSP90重组的方法，可随时用来探测HSP90真核细胞的功能活动，HSP90介导的类固醇激素受体 配体的结合，以及分子伴侣辅助因子的要求。例如，此法可用于测试HSP90的辅助因子的要求和加入外源性化合物的重组进程的影响。
遗传资源已经为研究HSP90一个特别有用的系统，必须绑定到HSP90，因为受体有一个开放的配体结合裂访问类固醇 3 。内源性的，unliganded的GR非共价的约束，以HSP90的哺乳动物细胞的细胞质中。如发现内源性GR•HSP90 heterocomplex，GR配体结合裂，是开放的和有约束力的类固醇的。如果从GR HSP90不赞成或如果其功能受到抑制，受体是无法绑定类固醇和需要重组的GR•HSP90 heterocomplex的结合活性类固醇之前恢复 4 。遗传资源，可以从细胞细胞质使用单克隆抗体免疫沉淀，如HSP90蛋白复合物，以遗传资源，可以通过免疫印迹检测。免疫沉淀的GR结合活性的类固醇，可以由孵化与[3H]类固醇immunopellet 。
以前的实验已经证明HSP90介导的GR配体裂约束力的开放需要HSP70，第二个分子伴侣，也为真核细胞的活力至关重要。 HSP90和HSP70的生化活性催化合作伴侣蛋白合，hsp40，和P23 5 。一个多蛋白的伴侣机械HSP90，HSP70，合，和hsp40是在真核细胞的细胞质内源性目前，网织红细胞裂解液提供了一个伴侣，含有丰富的蛋白质来源6。
提出的方法，GR是immunoadsorbed从细胞细胞质和内源性hsp90/hsp70伴侣用温和的盐条件下的机械剥离。盐剥离的GR然后孵育•HSP90 heterocomplex和类固醇的结合活性的激活7，网织红细胞裂解液，三磷酸腺苷，和K +，这在重组的GR结果。可以利用这种方法来测试各种伴侣的辅助因子，新的蛋白质，和实验HSP90或GR抑制剂的影响，以确定其HSP90介导的类固醇具有约束力8-11的功能意义。
Protocol
1。制备细胞细胞质中含有功能的GR
- 技术说明：所有的缓冲区应冷藏，此协议，包括离心和孵化，每一步应在冰上或在4 ° C，除非另有说明。低温是必不可少的，以防止GR和蛋白质复合物的降解。
- 使用冷冻离心机，取得了〜1-5毫升颗粒细胞功能的GR表达了高浓度。在遗传资源丰富的细胞来源的例子包括：小鼠成纤维L929细胞，它表达的内源性遗传资源的高浓度，并昆虫重组GR杆状病毒（如p2Bac 经理杆状病毒12）已被感染的细胞。大约15-20毫升包装细胞获得每昆虫杆状病毒细胞培养升。细胞应呈几何级数增长，前收获。在5000 × g离心5分钟的细胞悬液。
- 汉克斯“缓冲盐溶液15毫升，冲洗细胞沉淀三次。清洗，轻轻悬浮5分钟，随后在5000离心沉淀× G。最后一次洗涤，彻底去除上清。
- 准备7.5毫升含HEM的缓冲液（10 mM的HEPES，1毫米EDTA，20毫米钼酸钠，pH值7.4），1毫米苯甲基磺酰氟（PMSF），和3完成迷你蛋白酶抑制剂的地面片的缓冲一个同质化。 PMSF和完整的小片在随后的步骤防止发生水解。完整的迷你片，可以很容易地地面到细粉用迫击炮和杵。添加1.5卷同质缓冲细胞沉淀。
- 破裂Dounce同质化（50杆）或冻结/解冻（3次）技术的细胞。 Dounce同质化可能维持改善内源性的GR•HSP90蛋白复合物，并更快地完成。冻结/解冻提供研究人员一个机会，暂停在这一步的协议，并继续在稍后的时间。 Dounce同质化应与冰桶匀浆，以防止蛋白质的降解。冻结/解冻，可完成冻结的离心管中，含有颗粒同质化缓冲液的细胞用液氮，干冰或-20 ° C孵化，在30℃水浴解冻。
- 通过超速离心分离从破裂的细胞颗粒物质的GR含有细胞质。在100,000 × g匀浆转移耐用的超速离心机管，对群众的平衡管和离心30分钟。
- 取出500μL分装在长期储存的1.5毫升离心管，在-20细胞质（上清液）和存储° C。要保留的最大的功能GR活动，闪存冻结30秒甲醇干冰浴前存储在液态氮或孵化分装。一定要小心，以避免皮肤直接接触冷却剂。
2。从细胞细胞质遗传免疫吸附
- 技术说明：图2提供了这个协议的步骤2-5的示意图。
- 准备一个包含immunoadsorb在第1步准备的受体对GR提出一个单克隆免疫球蛋白（IgG）抗体的免疫吸附混合物。在1.5 ml离心管中，结合解冻的GR - 100μL含有细胞质中，200μLTEGM缓冲区（8毫米的工商业污水附加费，4毫米EDTA，50毫米的NaCl，20毫米的钼，10％（V / V）甘油，pH值7.6） 100μL20％的蛋白质A -琼脂糖凝胶（PAS）浆（V / V，准备在TEGM缓冲区），5微克抗- GR的单克隆抗体（如BuGR2）。钼是包括在TEGM缓冲区，以帮助稳定GR - HSP90 heterocomplex，这可能是有用的，以测定的内源性heterocomplex类固醇结合活动 13 。
- 反GR抗体纯化蛋白上市。另外，它可能会取得反GR的含有IgG的腹水免疫吸附混合物中加入10μL。腹水是由小鼠注射抗- GR杂交瘤细胞（如FiGR杂交瘤细胞14），并获得腹水和在这些实验中使用的是近似的抗体浓度为0.5μg/μL，Bradford法测定。
- 准备一个阴性对照样品，使用GR - 含有细胞质中，TEGM缓冲区，和首席助理秘书长（如上所述），一个IgG和5微克不承认的GR，HSP90，或其他分子伴侣蛋白（简称为“非免疫”抗体）。
- 由于比较大的PAS珠子大小，使用切割时的P - 200吸管尖转移的20％浆PAS样品管。切吸管提示准备切片2-3毫米市售的P - 200提示结束，从而增加了吸管尖光圈。
- 将样品在垂直旋转的轮子和2小时为一个不断旋转的最低孵化。样品可能长达8小时的孵育，而不失去活性。
- 在免疫吸附孵化结束，去除未结合的蛋白质抗体考绩颗粒（“immunopellet”）离心。从immunopellets分开使用一个冷冻离心机1分钟编程10,000 × G离心的上清液，然后用1 ml TEGM缓冲区和涡流清洗两次。经过离心和洗涤之间，弃上清，谨慎，不打扰颗粒。
- 删除所有在第二洗的结论上清。为了确保没有颗粒不经意地吸气，用压接的P - 200吸管尖，最终上清愿望。轧花吸管提示准备压扁市售的P - 200的提示使用镊子。
3。从遗传资源immunopellet内源性HSP90分解（“盐剥离”）
- 要洗immunopellet准备在第2步，添加355μL甘醇缓冲液（TEGM没有钼酸钠缓冲液）和45μL5 M氯化钠（NaCl浓度最终= 0.5米）。
- 将样品在垂直旋转的轮子和不断旋转的1.5小时的孵化。样品可以孵育长达2个小时，但是，较长的孵化，可能会导致减少蛋白质的恢复和功能活性较低。
- 取出离心的immunopellet未结合的蛋白质。 1分钟，在10000 × G.旋转样品洗一次1毫升甘醇缓冲区，并一度以1毫升10 mM的HEPES缓冲液，pH值7.4。
- 删除所有在第二洗的结论上清，小心，不要去打扰immunopellet，使用一个卷曲的P - 200吸管尖。
4。重组的GR•HSP90 heterocomplex使用分子伴侣，辅助因子，与ATP
- 技术说明：无数的实验条件，可以测试到准备下面的重组混合物，包括额外的蛋白质，辅助因子，激活剂，或利益抑制剂。重组混合物的总体积应<120μL。
- 每个盐剥离immunopellet准备在第3步，添加一个重建的混合物，含有50μL分子伴侣源和5μL一个ATP生成系统（10 mM的HEPES 50 mM的ATP，磷酸肌酸250毫米，20毫米醋酸镁100 U / ml的肌酸磷酸激酶，pH值7.4）。
- 重整反应，可能会增加补充重组混合物50μL港币缓冲液（10 mM的HEPES，氯化钾100毫米，5毫米二硫苏糖醇（DTT），pH值7.4）和ATP生成系统的一个额外的5μL。如果观察充足的重组和类固醇具有约束力，这一步可以省略。氯化钾增加HSP70的ATP酶活性及数码地面电视保护半胱氨酸含蛋白质氧化 9 。
- 一个推荐的分子伴侣来源是市售的兔网织红细胞裂解物。个别分子伴侣从网织红细胞裂解液纯化或重组表达（如15微克HSP90，HSP70 15微克，0.6微克合，P23 6微克和0.125微克港元缓冲区hsp40），也可使用。
- 在30℃水浴整整20分钟中孵育样品。弗里克管，以每1-2分钟，轻轻扰乱颗粒混合重组解决方案。
- 1分钟，加入1毫升TEGM缓冲区，旋涡，在10,000和离心机× G。小心，不要去打扰颗粒去除上清液并丢弃。共有3个洗重复。在缔结最终使用的P - 200压接吸管尖洗，彻底清除所有上清。
5。重组蛋白复合物与配体结合活性分析
- 在重组immunopellet中的蛋白质可以识别常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE），微流控电泳（如Bio - Rad公司的Experion），和免疫印迹（ 图 3 ）。技术说明：优秀的协议， 描述 15 SDS - PAGE电泳和免疫印迹 16目前，其他调查员的礼貌。
- 添加50μL的SDS - PAGE样品缓冲液含有β-巯基乙醇和涡。特定的样品缓冲液配方有所不同。被聘用的电泳系统的制造商建议的基础上，选择之一。
- 孵育5分钟，在沸水浴或100 ° C电子加热块。
- 在10,000 × g离心1分钟。 immunoadsorbing抗体，GR蛋白复合物遗传资源将脱离彼此释放到样品缓冲液上清中。
- 将上清转移至一个新的离心管，用吸管尖的P - 200压接尖。弃去沉淀。正准备用市售的SDS - PAGE或微流控电泳系统分析样品。完成两种技术following制造商的指示。
- Western blot分析以下的SDS - PAGE可为最终鉴定immunoadsorbed遗传和分子伴侣的GR复合重组孵化。使用对GR（BuGR2），HSP90（AC88）提出的单克隆抗体，HSP70（N27F3 4）和合作伴侣蛋白检测GR•HSP90蛋白复合物的主要成分。
- •HSP90蛋白复合物，可以通过化验使用类固醇的结合活性[3H] 类固醇（图 4）确定遗传资源的重组后，盐剥离的GR功能激活。对于该协议的其余部分，遵循必要的预防措施，安全处理氚的样品和废物。
- 重组后immunopellet，添加47.5μLHEM的缓冲区2微米和2.5μL[3H]地塞米松（最后的类固醇浓度= 100纳米） 。
- 轻轻地混合沉淀小心，尽量减少流离失所的样品量的离心管的墙。
- 在冰上孵育过夜。它是没有必要的旋转或在此孵化混合样品管的。
- 添加1毫升TEGM缓冲液，轻轻混匀，在10,000和离心机× G为1分钟。弃上清，被铭记，它包含未绑定的[3 H]类固醇。重复共3 TEGM缓冲液洗。
- 在缔结最终使用的P - 200压接吸管尖洗，彻底清除所有上清。颗粒包含的GR，HSP90和其他分子伴侣复合物的GR，[H]类固醇受体特异性结合。非特异性结合，可以计算，包括1000倍的超额非氚在地塞米松孵育过夜混合物。作为替代阴性对照，反GR immunoadsorbing抗体可能会被替换在步骤2.2中添加非GR - immunoadsorbing（NI）的抗体。
- 挂起200μLTEGM缓冲区，并转移至10 ml闪烁瓶使用的P - 200吸管尖切洗immunopellets。
- 加入4.8毫升闪烁鸡尾酒瓶和涡。
- [3H]类固醇结合到重组后的GR金额•HSP90蛋白复合物，可以使用液体闪烁光谱法测定。
6。代表性的成果：
代表SDS - PAGE和免疫印迹数据列在图3。内源性的GR•HSP90 heterocomplex immunoadsorbed使用反GR抗体和合作与GR immunoadsorb考马斯染色（图3A）显示的个别蛋白质从细胞的细胞质。蛋白质在重组实验的任何步骤的immunopellet任何组件的身份确认，可经SDS - PAGE计算分子量和使用提出对感兴趣的蛋白质的单克隆抗体免疫印迹。
冲调的GR•HSP90 heterocomplexes是使用的Experion微流体电泳数据（图3C和3D）和免疫印迹分析（图3B）。确认的GR免疫吸附特异性与非免疫抗体（图3C，NI IgG抗体车道）取代immunoadsorbing抗体抗- GR。即使过量使用非免疫抗体免疫沉淀，没有遗传或分子伴侣（参见图3c，GR，HSP90，HSP70蛋白带目前所观察到的带缺乏反GR免疫吸附车道NI IgG的车道）。同样，它可能证实了HSP90的分离和其他伴侣蛋白，盐剥离的剥离和重组immunopellets克免疫印迹分析（图3B）。考马斯染色和免疫印迹immunoadsorbing抗体的重链（HC）的检测，它是为了确认平等的大小immunopellets在每个泳道显示。
immunoadsorbed的GR结合活性的类固醇可以检测所有的测试条件，和有代表性的类固醇数据绑定在图4。内源性的GR•HSP90 heterocomplexes immunoadsorbed，盐剥离，重组。使用这两种网织红细胞裂解物或纯化的蛋白，重组的GR结合活性的类固醇•HSP90 heterocomplex通常返回的内源性GR•HSP90结合活性水平的75-100％。电泳数据相似，可能是一个非免疫抗体（NI）的反GR抗体（一）地方，以服务为阴性对照，并作为衡量非特异性[3H]类固醇具有约束力。
图1。GR•HSP90 heterocomplex大会和遗传资源类固醇结合裂开放模型。 hsp90/hsp70-based伴侣机械转换GR配体结合域从一个FOLDED的构象在类固醇结合裂是封闭的，而不是访问激素可以访问（杂环类固醇图标所示）一个开放的裂构象。伴侣机器预装在细胞和纯化HSP90，HSP70时，会自发形成，合溶液混合（反应1）。合包含34氨基酸tetratricopeptide重复（TPR）域（作为一个黑暗的新月所示），是后来在一个TPR域包含immunophilin蛋白heterocomplex成熟过程中所取代。机械打开类固醇结合的ATP和K +依赖性裂，后合和最hsp70和hsp40最终离开复杂的（图标为虚线所示）。机械，HSP70与GR相互作用之前HSP90和HSP90的受体素数的和随后裂开放。实验中，类固醇具有约束力和GR裂开放增加，如果HSP90和HSP70同时存在。 heterocomplex是稳定的HSP90合作伴侣P23，保持在一个ATP约束构型HSP90的条目。一个超高分子量immunophilin（IMM）合退出后，可以绑定HSP90，形成最终heterocomplex的，因为它是从细胞恢复。改编自普拉特和Toft 1。
图（2）本协议的步骤2-5的示意图。 GR是immunoadsorbed使用绑定的蛋白A琼脂糖凝胶颗粒的GR（FiGR）提出的一种单克隆抗体，对细胞的细胞质。 HSP90和其他伴侣蛋白存在于内源性的GR•HSP90 heterocomplex与GR合作immunoadsorbed，和GR是能够绑定到类固醇。 HSP90是脱离使用温和的盐处理盐剥离（STR），简称GR。类固醇具有约束力的盐剥离的GR裂闭合，使得它无法绑定到类固醇。中级GR•HSP90 heterocomplexes含有HSP70，hsp40，和跳，这是能够约束力的类固醇，可以重组，孵化与纯化蛋白质或网织红细胞裂解液（Retic裂解液）和辅助因子的盐剥离的GR（侦察）。类固醇的结合活性和immunopellet蛋白质含量每一步可以过夜[H]的类固醇孵化和免疫印迹分别确定。
图3。immunoadsorbed复合物电泳的蛋白质分析。一，重组的遗传资源的SDS - PAGE•HSP90 heterocomplex影像使用传统的电泳系统electrotransfer和考马斯染色。此外GR，HSP90和HSP70，重链（HC）和轻链抗体（立法会）的可视化。分子量标记（kDa的表达）的迁移，是显示在左侧。 B，含有盐剥克（STR）和重组GR•HSP90 heterocomplex（侦察）immunopellets免疫印迹。 ，重组遗传资源的虚拟凝胶•HSP90 heterocomplex使用的Experion微流体电泳系统生成的。包括两个不同浓度的一个非免疫（NI IgG抗体），免疫（抗- GR）immunoadsorbing抗体。 NI的IgG为阴性对照。研发，电泳重组的GR•HSP90的Experion微流体电泳显示面板B.微流控电泳的优点，包括较小的样本量的要求第三线的样品获得的heterocomplex，降低液体处理和运行后清理，提高了量化，并大幅较短的样品运行。
图4。类固醇结合活性，免疫吸附内源性的GR（Enodg），盐剥离的GR（STR）immunopellets和重组的GR•HSP90 heterocomplex（侦察）。此外，immunoadsorbing单克隆抗- GR immunoadsorbing抗体（一）GR，每个条件的阴性对照样品，使用非免疫球蛋白（NI）的准备。
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Discussion
上文所述的检测可以适应测试无数影响hsp90/hsp70-based伴侣机械伴侣行动以及GR类固醇具有约束力的条件。这是以前报道的方法 4,8,9,17的修改，旨在充分利用电泳技术的最新进展，并接触到更广泛的研究界。可以添加额外的辅助因子或蛋白质的利益，在GR•HSP90 heterocomplex重组的混合物，在本议定书第4步中所述，以观察对类固醇的约束力，heterocomplex蛋白质相互作用，并共同因素的要求影响。例如，缺血再灌注的影响HSP90功能可以模拟与活性氧物种的浓度的增加除了。可加入具有特定功能（如乙酰化HSP90）或潜在的Hsp90抑制剂（如新的格尔德霉素类似物）的纯化蛋白质，以便确定的类固醇的约束力和heterocomplex形成的影响。
下游不同的检测比电泳，免疫印迹和类固醇结合实验也可聘用。例如，免疫沉淀多蛋白复合物进行了分析，通过流式细胞仪检测有大量的成功18,19。 immunoadsorbed的GR•HSP90复合物也可能被检测hsp90/hsp70核苷酸状态或可视化使用原子力显微镜17。 Hsp90的客户端的GR蛋白可用于（例如chaperoning检查点激酶（CHK1）20），并已进行了开创性研究，使用此协议的变化与雌激素受体 ，孕激素受体 ， 和 SRC 1,13,21。
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Disclosures
选择电泳试剂和图像分析软件是由Bio - Rad公司提供的。
Acknowledgments
这项工作是由国家健康授予GM086822，希望心脏研究所的基础科学奖，兆焦耳默多克慈善信托基金科学学院研究计划研究院资助。选择电泳试剂和图像分析软件Bio - Rad公司提供的慷慨。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
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