Summary
و
Abstract
Hsp90 هو ضروري للغاية وفيرة من البروتين كوصي الجزيئية التي تم العثور على تنظيم أكثر من 150 إشارة حقيقية النواة البروتينات ، بما في ذلك عوامل النسخ (المستقبلات النووية على سبيل المثال ، البروتين p53) وتحركات البروتينات (مثل SRC ، راف ، AKT كيناز) المشاركة في دورة الخلية ، تكون الأورام ، موت الخلايا المبرمج ، وعدة مسارات إشارات حقيقية النواة 1،2. كثير من هذه البروتينات "عميل" لhsp90 ، والتجمع من مستقبلات الستيرويد • hsp90 المجمعات هو أفضل تعريف (الشكل 1). نقدم هنا لتلقي تكيف جلايكورتيكود (اليونان) وفحص مناعي في المختبر GR • أسلوب إعادة hsp90 التي يمكن استخدامها بسهولة لتحقيق حقيقية النواة hsp90 النشاط الوظيفي ، hsp90 بوساطة مستقبلات الستيرويد يجند ملزمة ، ومتطلبات العامل المساعد كوصي الجزيئية. على سبيل المثال ، يمكن استخدام هذا الاختبار لاختبار متطلبات العامل المساعد hsp90 وتأثيرات خارجية مضيفا المركبات لعملية إعادة.
كان نظام GR مفيدة بشكل خاص لدراسة hsp90 لأنه يجب أن تكون ملزمة لمستقبلات hsp90 أن يكون لها ملزم يجند فتح المشقوق يمكن الوصول إلى 3 الستيرويد. الذاتية ، GR unliganded موجودة في السيتوبلازم من خلايا الثدييات ملزمة لnoncovalently hsp90. كما وجدت في الموارد الوراثية المحلية • hsp90 heterocomplex ، وملزم يجند GR المشقوق مفتوحة وقادرة على الستيرويد ملزمة. إذا تم استعادة hsp90 تنأى عن GR أو إذا تحول دون وظيفتها ، ومستقبلات غير قادر على ربط الستيرويد ويتطلب إعادة تشكيل لGR • hsp90 heterocomplex قبل النشاط ملزمة الستيرويد 4. يمكن immunoprecipitated GR العصارة الخلوية من خلية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، والبروتينات مثل hsp90 المعقد للGR يمكن يعاير بواسطة لطخة غربية. يمكن تحديد النشاط ملزمة الستيرويد لGR immunoprecipitated التي تفرخ في immunopellet مع [3 H] الستيرويد.
وقد أظهرت التجارب السابقة hsp90 بوساطة افتتاح GR ملزم يجند المشقوق يتطلب hsp70 ، وهو second كوصي الجزيئية الأساسية أيضا لبقاء الخلية حقيقية النواة. وحفز النشاط الكيميائي الحيوي لhsp90 hsp70 والبروتينات التي هوب المشترك كوصي ، hsp40 ، و 5 P23. وتعتبر الأجهزة التي تحتوي على كوصي multiprotein hsp90 ، hsp70 ، هوب ، والتطور الطبيعي hsp40 هي موجودة في السيتوبلازم الخلية حقيقية النواة ، وlysate بالشبكيات يوفر كوصي الغنية مصدر بروتين 6.
في أسلوب عرضه ، هو immunoadsorbed GR من العصارة الخلوية المحمولة وتجريده من آلات كوصي hsp90/hsp70 الظروف الذاتية باستخدام ملح خفيف. ومن ثم حضنت GR الملح مع تجريده lysate بالشبكيات ، ATP ، و+ K ، والذي ينتج إعادة تشكيل GR • hsp90 heterocomplex وتفعيل النشاط ملزمة الستيرويد 7. ويمكن استخدام هذا الأسلوب لاختبار تأثير العوامل المساعدة كوصي مختلف البروتينات الرواية ، والتجريبية ، أو مثبطات hsp90 GR من أجل تحديد أهميتها الفنية بشأن 8-11 hsp90 بوساطة ملزمة الستيرويد.
Protocol
1. إعداد العصارة الخلوية الخلية التي تحتوي على الموارد الوراثية وظيفية
- ملاحظة فنية : جميع مخازن مبردة وينبغي أن يتم تنفيذ كل خطوة من هذا البروتوكول ، بما في ذلك centrifugations والحضانة ، أو على الجليد في 4 درجات مئوية ، إلا إذا ذكر خلاف ذلك. درجة حرارة منخفضة أمر ضروري لمنع تدهور المجمعات الوراثية والبروتينات.
- باستخدام أجهزة الطرد المركزي المبردة ، للحصول على ~ 1-5 مل بيليه من الخلايا التي تعبر عن درجة تركيز عالية من الموارد الوراثية وظيفية. أمثلة من المصادر الغنية في الخلايا الوراثية وتشمل الماوس الخلايا الليفية L929 ، التي تعبر عن درجة تركيز عالية من الموارد الوراثية المحلية ، وSf9 الخلايا التي تم المصابين المؤتلف الفيروسة العصوية GR (مثل الفيروسة العصوية p2Bac MGR - 12). يتم الحصول على حوالي 15-20 مل من الخلايا معبأة للتر الواحد من Sf9 الفيروسة العصوية ثقافة الخلية. وينبغي أن تكون الخلايا المتنامية باطراد قبل الحصاد. تعليق الطرد المركزي في الخلية ز × 5000 لمدة 5 دقائق.
- غسل الخلية بيليه ثلاث مرات مع 15 مل من محلول هانكس "مخزنة المالحة. بين يغسل ، resuspend بلطف بيليه ، تليها الطرد المركزي في 5000 × ز لمدة 5 دقائق. بعد غسل الماضي ، تماما إزالة طاف.
- إعداد 7.5 مل من التجانس العازلة التي تحتوي على العازلة HEM (HEPES 10 ملم ، 1 ملم EDTA ، موليبدات الصوديوم 20 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4) ، 1 فلوريد phenylmethylsulfonyl ملم (PMSF) ، وأقراص الأرض 3 من مثبطات الأنزيم البروتيني الكامل المصغر. وPMSF وأقراص كاملة المصغر منع حدوث التحلل البروتيني أثناء الخطوات اللاحقة. يمكن أن تكون كاملة المصغر أقراص الأرض بسهولة إلى مسحوق ناعم مع هاون ومدقة. إضافة 1.5 حجم المخزن المؤقت للتجانس بيليه الخلية.
- تمزق الخلايا عن طريق التجانس Dounce (50 السكتات الدماغية) أو تجميد / الذوبان (3 دورات) التقنية. قد تجانس Dounce الحفاظ على الموارد الوراثية المحلية وتحسين • مجمعات البروتين hsp90 وأسرع لإكمال. تجميد / الذوبان يقدم الباحث فرصة للتعليق على البروتوكول في هذه الخطوة والاستمرار في وقت لاحق. يجب أن يتم تنفيذ Dounce التجانس مع الخالط في دلو الثلج لمنع تدهور البروتين. ويمكن تحقيق تجميد / الذوبان من خلال تجميد أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على خلية بيليه - تجانس الخليط العازلة مع النيتروجين السائل والثلج الجاف ، أو حضانة -20 درجة مئوية ، تليها ذوبان في الماء 30 درجة مئوية حمام.
- فصل العصارة الخلوية التي تحتوي على الموارد الوراثية من هذه المسألة التي تمزق الخلايا الجسيمات تنبيذ فائق. نقل جناسة لأنابيب نابذة فائقة السرعة دائمة ، وأنابيب التوازن الشامل في أزواج ، والطرد المركزي في ز × 100000 لمدة 30 دقيقة.
- إزالة العصارة الخلوية (طاف) وتخزينها في -20 درجة مئوية في 500 aliquots ميكرولتر في 1.5 مل microcentrifuge أنابيب لتخزين طويل الأجل. الإبقاء على الحد الأقصى GR النشاط الوظيفي ، فلاش تجميد aliquots في النيتروجين السائل أو احتضان لمدة 30 ثانية في الميثانول الجاف حمام جليدي قبل التخزين. الحيطة والحذر لتجنب الاتصال المباشر مع الجلد الكاشف التبريد.
2. امتزاز مناعي الموارد الوراثية من خلية العصارة الخلوية
- ملاحظة فنية : الشكل 2 يقدم عرضا التخطيطي لخطوات 2-5 من هذا البروتوكول.
- تحضير مزيج يحتوي على امتزاز مناعي وحيدة النسيلة المناعي G (مفتش) الأجسام المضادة التي أثيرت ضد GR immunoadsorb لمستقبلات أعدت في الخطوة 1. في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge ، والجمع بين 100 ميكرولتر من إذابة GR التي تحتوي على العصارة الخلوية ، 200 العازلة TEGM ميكرولتر (TES 8 ملم ، 4 ملم EDTA ، كلوريد الصوديوم 50 ملي و 20 ملي موليبدات ، 10 ٪ (V / V) الجلسرين ، ودرجة الحموضة 7.6) ، 100 ميكرولتر من البروتين 20 ٪ Sepharose - (PAS) الطين (V / V ، الذي أعد في TEGM العازلة) ، و 5 ميكروغرام المضادة للمفتش الأضداد وحيدة النسيلة GR (مثل BuGR2). يتم تضمين موليبدات في المنطقة العازلة TEGM من أجل المساعدة على تحقيق الاستقرار في GR - hsp90 heterocomplex ، والتي قد تكون مفيدة من أجل فحص النشاط الذاتية heterocomplex ملزمة الستيرويد 13.
- GR المضادة للأجسام المضادة متاح تجاريا باسم تنقية البروتين. بدلا من ذلك ، قد يتم الحصول عليها عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من استسقاء مفتش المحتوية على مكافحة GR إلى خليط امتزاز مناعي. ويتم إنتاج استسقاء الفئران التي حقنت بخلايا ورم هجين مكافحة GR (مثل خلايا ورم هجين FiGR 14) ، وتركيز الضد التقريبية التي تم الحصول عليها من استسقاء واستخدمت في هذه التجارب هو 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر ، مقاسا مقايسة برادفورد.
- تحضير عينة التحكم باستخدام الموارد الوراثية السلبية التي تحتوي على العصارة الخلوية ، TEGM العازلة ، وتقييم الأداء (كما هو موضح أعلاه) ، و 5 ميكروغرام من مفتش الحكومة التي لا تعترف GR ، hsp90 ، أو غيرها من البروتينات كوصي الجزيئية (ويشار اليها باعتبارها "nonimmune" الضد).
- بسبب الحجم الكبير نسبيا حبة PAS ، واستخدام قطع P - 200 طرف الماصة عند نقل PAS من الطين 20 ٪ لأنابيب العينات. مستعدون نصائح الماصة قطع طريق تشريح 2-3 مم الخروج من نهاية نصائح P - 200 متوفرة تجاريا ، وبالتالي زيادة الفتحة طرف الماصة.
- عينات من مكان على عجلة دوارة العمودي واحتضان مدة لا تقل عن 2 ساعة مع دوران مستمر. عينات قدتكون المحتضنة لمدة تصل إلى 8 ساعات من دون خسارة من النشاط.
- في ختام لحضانة امتزاز مناعي ، وإزالة البروتينات غير منضم من بيليه الضد لتقييم الأداء ("immunopellet") عن طريق الطرد المركزي. فصل من supernatants immunopellets بواسطة الطرد المركزي تستخدم أجهزة الطرد المركزي المبردة المبرمجة ل1 دقيقة عند 10000 × غرام ، ويغسل ثم مرتين مع 1 مل TEGM العازلة والدوامة. بعد الطرد المركزي وبين يغسل ، تجاهل طاف الحذر حتى لا تعكر صفو بيليه.
- إزالة كافة طاف في ختام غسل الثانية. من أجل ضمان أن يستنشق عن غير قصد أي من بيليه ، واستخدام مجعد P - 200 طرف الماصة للتطلع طاف النهائي. مستعدون نصائح الماصة معقوص بواسطة تسطيح المتاحة تجاريا P - 200 نصائح باستخدام ملقط.
3. تفكك hsp90 الذاتية من immunopellet GR ("ملح تجريد")
- لغسلها immunopellet أعد في الخطوة 2 ، إضافة 355 ميكرولتر TEG العازلة (TEGM العازلة دون موليبدات الصوديوم) و 45 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم M 5 (كلوريد الصوديوم تركيز النهائي = 0.5 M).
- عينات من مكان على عجلة دوارة العمودي واحتضان لمدة 1.5 ساعات مع دوران مستمر. يمكن حضنت العينات لمدة تصل الى 2 ساعة ، ومع ذلك ، يعد حضانات قد يؤدي إلى الانتعاش والنشاط انخفض البروتين أقل وظيفية.
- إزالة البروتينات غير منضم من immunopellet بواسطة الطرد المركزي. تدور العينات لمدة 1 دقيقة في غرام × 10000 يغسل مرة واحدة مع 1 مل TEG العازلة ومرة واحدة مع 1 مل من 10 ملي HEPES العازلة ، ودرجة الحموضة 7.4.
- إزالة كافة طاف في ختام غسل الثاني ، والحرص على عدم تعكير صفو immunopellet ، وذلك باستخدام P - 200 معقوص طرف الماصة.
4. • إعادة تشكيل GR hsp90 heterocomplex به المحرمين الجزيئية ، والعوامل المساعدة ، و ATP
- ملاحظة فنية : يمكن اختبار لعدد لا يحصى من الظروف التجريبية بما في ذلك البروتينات التي كتبها إضافية ، العوامل المساعدة ، تفعيل ، أو مثبطات مصلحة في إعادة إعداد خليط أدناه. وينبغي أن إجمالي حجم إعادة مخاليط تكون <120 ميكرولتر.
- إلى كل الملح جردت immunopellet أعد في الخطوة 3 ، إضافة إلى إعادة تشكيل خليط يحتوي على 50 ميكرولتر من مصدر كوصي الجزيئية و 5 ميكرولتر من نظام توليد ATP (HEPES 10 ملم و 50 ملم للاعبي التنس المحترفين ، 250 ملي فوسفات الكرياتين ، 20 ملي المغنيسيوم خلات ، 100 فسفوكيناز الكرياتين يو / مل ، ودرجة الحموضة 7.4).
- ويمكن زيادة ردود الفعل من خلال استكمال إعادة المخلوط مع 50 العازلة إعادة HKD ميكرولتر (HEPES 10 مم ، 100 مم بوكل ، 5 ملي dithiothreitol (DTT) ، ودرجة الحموضة 7.4) ، بالإضافة إلى 5 ميكرولتر من بطولة لتوليد النظام. ويمكن حذف هذه الخطوة إذا لوحظ وافرة وإعادة الربط الستيرويد. بوكل hsp70 يزيد النشاط وأتباز DTT يحمي السيستين المحتوية على البروتينات من الأكسدة 9.
- وأوصى المصدر كوصي الجزيئية المتاحة تجاريا lysate بالشبكيات الأرانب. المحرمين الجزيئية الفردية تنقيته من lysate بالشبكيات أو أعربت عن recombinantly (على سبيل المثال 15 ميكروغرام hsp90 ، 15 ميكروغرام hsp70 ، و 0.6 ميكروغرام هوب ، 6 ميكروغرام P23 ، و0،125 ميكروغرام في hsp40 العازلة HKD) قد تستخدم أيضا.
- احتضان العينات في المياه 30 درجة مئوية لمدة الحمام 20 دقيقة بالضبط. أنابيب نفض الغبار كل دقيقة 1-2 من أجل زعزعة بلطف بيليه وإعادة خلط الحل.
- إضافة 1 مل TEGM العازلة ، الدوامة ، والطرد المركزي في 10000 × ز ل 1 دقيقة. إزالة طاف وتجاهل والحرص على عدم تعكير صفو بيليه. لتكرار ما مجموعه ثلاثة يغسل. إزالة كافة طاف في ختام غسل النهائي باستخدام مجعد P - 200 غيض الماصة.
5. تحليل البروتين المعاد المجمعات والنشاط يجند ملزم
- يمكن التعرف على البروتينات في immunopellet الذي أعيد تشكيله التقليدية تغيير طبيعة بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (SDS - PAGE) ، ميكروفلويديك الكهربائي (مثل بيو راد Experion) ، والغربية النشاف (الشكل 3). ملاحظة فنية : بروتوكولات ممتاز تصف SDS - PAGE 15 و 16 غرب النشاف متاحة حاليا ، من باب المجاملة محققين آخرين.
- إضافة ميكرولتر من 50 عينة العازلة SDS - PAGE تحتوي على β - المركابتويثانول والدوامة. وصفات محددة العازلة العينة تختلف. اختر واحدا بناء على توصية من الشركة المصنعة للنظام الكهربائي المزمع استخدامها.
- احتضان لمدة 5 دقائق في حمام ماء مغلي أو 100 درجة مئوية كتلة الحرارة الالكترونية.
- الطرد المركزي في ز × 10000 ل 1 دقيقة. فإن الأجسام المضادة immunoadsorbing ، GR ، والبروتينات المعقد لGR يمكن فصلها عن بعضها البعض ، وتطلق في عينة طاف العازلة.
- طاف لنقل أنبوب microcentrifuge جديدة باستخدام تلميح تلميح معقوص P - 200 الماصة. تجاهل بيليه. مستعدة الآن لتحليل العينة باستخدام متاحة تجاريا SDS - PAGE أو أنظمة ميكروفلويديك الكهربائي. إما إكمال و تقنيةollowing تعليمات الشركة الصانعة.
- تحليل لطخة غربية التالية SDS - PAGE يسمح لتحديد نهائي للGR immunoadsorbed والمحرمين الجزيئي المعقد للGR بعد إعادة حضانة. الأجسام المضادة وحيدة النسيلة استخدام الأولية التي أثيرت ضد GR (BuGR2) ، hsp90 (AC88) ، hsp70 (N27F3 - 4) والبروتينات كوصي المشترك للكشف عن العناصر الرئيسية للGR • بروتين معقد hsp90.
- وظيفية تفعيل GR الملح جردت التالية إعادة تشكيل GR يمكن التعرف على البروتين hsp90 • المعقدة التي يعاير النشاط ملزمة باستخدام الستيرويد [3 H] الستيرويد (الشكل 4). للفترة المتبقية من البروتوكول ، اتبع الاحتياطات اللازمة للتعامل مع العينات معالج بالتريتيوم بأمان والنفايات.
- لimmunopellet المعاد ، إضافة 47.5 العازلة HEM ميكرولتر و 2.5 ميكرومتر ميكرولتر من 2 [3 H] ديكساميثازون (تركيز الستيرويد النهائي = 100 نانومتر).
- المزيج برفق بيليه الحرص على تقليل كمية العينة المشردين إلى جدار الأنبوب microcentrifuge.
- يحضن بين عشية وضحاها على الجليد. ليس من الضروري لتدوير أو مزيج أنابيب العينات خلال هذه الحضانة.
- إضافة 1 مل TEGM العازلة ، مزيج بلطف ، والطرد المركزي في 10000 × ز ل 1 دقيقة. تجاهل طاف ، لأنها تدرك أنها غير منضم يحتوي [3 H] الستيرويد. تكرار لما مجموعه 3 يغسل مع TEGM العازلة.
- إزالة كافة طاف في ختام غسل النهائي باستخدام مجعد P - 200 غيض الماصة. ويحتوي بيليه GR ، المحرمين الجزيئية hsp90 وغيرها من المعقد إلى GR ، و [3 H] الستيرويد ملزمة على وجه التحديد إلى مستقبلات. ويمكن حساب ملزم غير محدد من قبل بما في ذلك 1000 - أضعاف ديكساميثازون غير معالج بالتريتيوم الزائدة في حضانة خليط بين عشية وضحاها. والسيطرة على السلبية بديل ، وأضاف المضادة GR - الضد immunoadsorbing 2.2 في الخطوة يمكن أن يستبدل مع غير GR - immunoadsorbing الأضداد (NI).
- تعليق immunopellets غسلها في 200 العازلة TEGM ميكرولتر ونقل إلى 10 قارورة التلألؤ مل باستخدام قطع P - 200 طرف الماصة.
- إضافة 4.8 مل كوكتيل التلألؤ لقوارير والدوامة.
- يمكن للمبلغ [3 H] الستيرويد ملزمة لتشكيل GR أن يعاير • بروتين معقد hsp90 باستخدام السائل قياس الطيف التلألؤ.
6. ممثل النتائج :
وتعرض ممثل SDS - PAGE والبيانات لطخة غربية في الشكل 3. الموارد الوراثية المحلية وimmunoadsorbed • hsp90 heterocomplex من العصارة الخلوية الخلية استخدام الألغام المضادة للGR الأضداد والبروتينات الفردية التي شاركت في immunoadsorb مع GR هي تصور عن طريق تلوين Coomassie (الشكل 3A). ويمكن إجراء تأكيد هوية البروتين من أي عنصر من عناصر immunopellet في أي خطوة في إعادة فحص بواسطة SDS - PAGE حساب الوزن الجزيئي والنشاف الغربية باستخدام الاجسام المضادة التي أثيرت ضد هذا البروتين في المصالح.
GR المعاد ترد • hsp90 heterocomplexes باستخدام بيانات Experion ميكروفلويديك الكهربائي (الشكل 3C و 3D) وتحليل لطخة غربية (الشكل 3B). يتم تأكيد خصوصية امتزاز مناعي GR بالاستعاضة عن immunoadsorbing مكافحة GR الضد مع الضد nonimmune (الشكل 3C ، NI الممرات مفتش). حتى عندما يتم استخدام كميات كبيرة من الأجسام المضادة nonimmune ، يتم immunoprecipitated أي مرافقين أو GR الجزيئية (راجع في الشكل 3C ، والموارد الوراثية ، hsp90 ، وشرائح البروتين hsp70 موجودة في الممرات امتزاز مناعي مكافحة GR مع عدم وجود الفرقة التي لوحظت في NI الممرات مفتش). وبالمثل ، فمن الممكن للتأكد من تفكك البروتينات كوصي hsp90 وغيرها من الموارد الوراثية الملح تجريده من خلال تحليل لطخة غربية (الشكل 3B) من immunopellets جردت والمعاد. سلسلة كبيرة من الأجسام المضادة immunoadsorbing (HC) هو وصمة عار للاكتشاف من قبل كل من والغربية Coomassie النشاف ، وأنه يعمل على تأكيد المساواة immunopellets الحجم يجري تصور في كل حارة.
يمكن أن يعاير النشاط ملزمة الستيرويد لGR immunoadsorbed بواسطة لظروف كل اختبار ، وقدم ممثل الستيرويد ربط البيانات في الشكل 4. GR الذاتية هي immunoadsorbed • hsp90 heterocomplexes ، والملح ، تجريد ، والمعاد. باستخدام إما lysate بالشبكيات أو المنقى البروتينات ، والنشاط ملزمة الستيرويد لتشكيل GR • hsp90 heterocomplex يعود عادة إلى 75-100 ٪ من الموارد الوراثية المحلية • hsp90 مستوى النشاط ملزمة. مماثلة للبيانات الكهربائي ، قد يتم استخدام الأجسام المضادة nonimmune (NI) في مكان من جسم مضاد GR - (I) من أجل أن تكون بمثابة سيطرة السلبية وكمقياس لانوعية [3 H] ملزمة الستيرويد.
الشكل 1. موديل • GR التجمع heterocomplex hsp90 وGR الستيرويد افتتاح المشقوق ملزمة. آلية كوصي hsp90/hsp70-based يحول المجال يجند GR ملزم من فلدائرة التنمية الاقتصادية في التشكل الذي هو ملزم الستيرويد المشقوق مغلقة وليس في متناول لهرمون التشكل an المشقوق فتح التي يمكن الوصول إليها (يتضح من رمز غير متجانسة الستيرويد). غير مجمعة سلفا الآلية كوصي في الخلية ، وستشكل تلقائيا بعد تنقيته hsp90 ، hsp70 ، وتختلط قفزة في الحل (الرد 1). هوب يحتوي على الأحماض الأمينية 34 tetratricopeptide تكرار (TPR) المجال (كما هو موضح هلال الظلام) ، ويتم استبداله في وقت لاحق خلال عملية نضوج heterocomplex بواسطة TPR المجال التي تحتوي على البروتين immunophilin. آلية ملزمة بفتح الستيرويد المشقوق بطريقة تعتمد على + و K - ATP ، وبعد ذلك قفزة ومعظم hsp70 في نهاية المطاف وhsp40 مغادرة المجمع (كما هو موضح رمز متقطع). ميكانيكيا ، hsp70 يتفاعل مع GR قبل hsp90 يعبي والمستقبلة للhsp90 وفتح شق اللاحقة. تجريبيا ، وزيادة الربط وفتح الستيرويد GR المشقوق وإذا hsp90 hsp70 موجودة في نفس الوقت. واستقرت heterocomplex بواسطة دخول P23 المشترك كوصي hsp90 ، الذي يحافظ hsp90 في التشكل ATP محدد. بعد خروج هوب ، يمكن لارتفاع الوزن الجزيئي immunophilin (IMM) ربط hsp90 ، وتشكيل heterocomplex النهائي كما هو استعادتها من الخلايا. مقتبس من برات وتوفت 1.
الشكل 2. تمثيل تخطيطي للخطوات 2-5 من هذا البروتوكول. هو immunoadsorbed الموارد الوراثية من خلية العصارة الخلوية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة التي أثيرت ضد GR (FiGR) منضما إلى بيليه من البروتين A - Sepharose. Hsp90 والبروتينات كوصي الأخرى الموجودة في GR الذاتية هي • hsp90 heterocomplex التعاون مع immunoadsorbed GR ، والموارد الوراثية قادرة على ربط الستيرويد. Hsp90 هو فصلها عن GR العلاج باستخدام الملح معتدل ، ويشار إلى الملح تجريد (شارع). الربط الستيرويد المشقوق من الملح GR - جردت يغلق ، مما يجعلها غير قادرة على ربط الستيرويد. وسيطة يمكن أن يعاد تشكيل GR • hsp90 heterocomplexes تتضمن hsp70 ، hsp40 ، وهوب ، والتي هي قادرة على الستيرويد ملزمة ، (ريكون) التي يحتضنها والملح مع تجريده GR تنقية البروتينات أو lysate بالشبكيات (Retic lysate) والعوامل المساعدة. يمكن التعرف على النشاط الستيرويد ملزمة وimmunopellet محتوى البروتين في كل خطوة بين عشية وضحاها [3 H] حضانة الستيرويد والنشاف الغربية ، على التوالي.
الشكل 3. تحليل الكهربي البروتين المجمعات immunoadsorbed. A ، SDS - PAGE الموارد الوراثية المعاد • hsp90 heterocomplex المصورة التقليدية باستخدام نظام الكهربائي تليها electrotransfer وتلطيخ Coomassie. بالإضافة إلى الموارد الوراثية ، hsp90 وhsp70 ، وسلسلة ثقيلة (HC) وسلسلة الخفيفة (LC) من الأضداد : هي تصور. يشار إلى الهجرة من علامات الوزن الجزيئي (كيلو دالتون وأعرب في) على اليسار. باء ، وصمة عار immunopellets الغربية التي تحتوي على الملح جردت GR (شارع) وأعيد GR • hsp90 heterocomplex (ريكون). C ، هلام الظاهري GR المعاد • hsp90 heterocomplex إنشاؤها باستخدام نظام Experion ميكروفلويديك الكهربائي. وشملت اثنين من تركيزات مختلفة من nonimmune (NI مفتش الحكومة) والجهاز المناعي (المضادة للGR) immunoadsorbing الأضداد. الجماعات الحكومية الدولية NI بمثابة الضوابط سلبية. D ، من مخطط رحلاني GR المعاد • انخفض hsp90 heterocomplex تم الحصول عليها من عينة Experion ميكروفلويديك الكهربائي هو مبين في الممر الثالث من مزايا باء فريق الكهربائي ميكروفلويديك تشمل متطلبات حجم عينة أصغر ، ومناولة السائل وتنظيف ما بعد التشغيل ، وتحسين القياس الكمي ، وإلى حد كبير أقصر عينة تشغيله.
الشكل 4. الستيرويد من النشاط ملزمة immunopellets التالية امتزاز مناعي الموارد الوراثية المحلية (Enodg) ، والملح ، جردت GR (شارع) ، وأعيد تشكيلها GR • hsp90 heterocomplex (ريكون). بالإضافة إلى الموارد الوراثية immunoadsorbing مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للGR immunoadsorbing (I) ، تم إعداد عينات السيطرة السلبية لكل حالة استخدام المناعي nonimmune (NI).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن تكييف مقايسة المذكورة أعلاه لاختبار عدد لا يحصى من الظروف التي تؤثر على الإجراءات كوصي الآلية كوصي hsp90/hsp70-based فضلا GR ملزمة الستيرويد. بل هو تعديل أساليب ذكرت سابقا 4،8،9،17 ويهدف إلى الاستفادة من التطورات الحديثة في مجال التكنولوجيا الكهربائي ويمكن الوصول إلى مجتمع أوسع البحوث. ويمكن إضافة العوامل المساعدة إضافية أو البروتينات التي تهم GR • إعادة heterocomplex hsp90 الخليط ، وصفت في الخطوة 4 من البروتوكول ، من أجل مراقبة التأثيرات على الستيرويد ملزمة ، وتفاعلات البروتين البروتين heterocomplex ، ومتطلبات التعاون عامل. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون على غرار آثار ضخه الإسكيمية ، الدالة على hsp90 مع إضافة زيادة تركيزات أنواع الاكسجين التفاعلية. يمكن إضافة تنقية البروتينات مع ميزة معينة (hsp90 الأسيتيل على سبيل المثال) أو المحتملة hsp90 مثبطات (على سبيل المثال النظير geldanamycin رواية) من أجل آثارها على الستيرويد تشكيل heterocomplex ملزمة ويتم تحديدها بعد.
أسفل تيار الكهربائي من فحوصات مختلفة ، يمكن أيضا فحوصات ملزمة الغربية النشاف ، والستيرويد يمكن استخدامها. على سبيل المثال ، تم تحليلها من قبل المجمعات multiprotein immunoprecipitated التدفق الخلوي مع 18،19 نجاحا كبيرا. قد GR immunoadsorbed • كما أن يعاير hsp90 مجمعات للدولة النوكليوتيدات hsp90/hsp70 أو تصور ذرية باستخدام المجهر قوة 17. ويمكن استخدام البروتينات العميل Hsp90 غيرها من الموارد الوراثية (مثل حاجز المرافقة أنا كيناز (Chk1) 20) ، ولقد أجريت بحوث المنوية باستخدام أشكال مختلفة من هذا البروتوكول مع مستقبلات هرمون الاستروجين ، ومستقبلات هرمون البروجسترون ، وSRC 1،13،21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
حدد الكواشف الكهربي وقدمت صورة برامج التحليل بواسطة بيو راد.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM086822 ، الأمل معهد القلب جائزة العلوم الأساسية ، وموردوك MJ الخيرية كلية العلوم الاستئماني برنامج البحوث. حدد الكواشف الكهربي وقدمت بسخاء صورة برامج التحليل بواسطة بيو راد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. estern Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
