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Biology

Reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines Hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand

doi: 10.3791/3059 Published: September 21, 2011

Summary

Une

Abstract

Hsp90 est une protéine chaperonne essentiel et très abondante moléculaire qui a été trouvé pour régler plus de 150 eucaryotes protéines de signalisation, y compris les facteurs de transcription (par exemple les récepteurs nucléaires, p53) et les protéines kinases (par exemple, Src, Raf, protéine Akt) impliqués dans le cycle cellulaire, tumorigenèse, l'apoptose, la signalisation et les multiples voies de 1,2 eucaryotes. Parmi ces nombreuses «client» pour les protéines HSP90, l'assemblage des récepteurs stéroïdiens • hsp90 complexes est mieux définis (figure 1). Nous présentons ici un récepteur adapté aux glucocorticoïdes (GR) de dosage immuno-précipitation et in vitro GR • La méthode de reconstitution hsp90 qui peut être facilement utilisé pour sonder eucaryotes hsp90 activité fonctionnelle, hsp90 médiée ligand du récepteur de liaison des stéroïdes, et moléculaire exigences cofacteur chaperon. Par exemple, ce test peut être utilisé pour tester HSP90 exigences cofacteur et les effets de l'ajout de composés exogènes au processus de reconstitution.

Le GR a été un système particulièrement utile pour étudier parce hsp90 le récepteur doit être lié à hsp90 d'avoir une liaison d'un ligand ouverte fissure qui est accessible à trois stéroïdes. Endogènes, GR unliganded est présent dans le cytoplasme des cellules de mammifères non covalente lié à hsp90. Comme l'a constaté dans le GR endogène • hsp90 hétérocomplexe, la fixation du ligand GR fente est ouverte et capable de liaison des stéroïdes. Si hsp90 dissocie du GR ou si sa fonction est inhibée, le récepteur est incapable de se lier de stéroïdes et nécessite la reconstitution de la GR • hsp90 hétérocomplexe avant l'activité de liaison des stéroïdes est restaurée 4. GR peut être immunoprécipité du cytosol des cellules en utilisant un anticorps monoclonal, et des protéines telles que hsp90 complexé à la GR peut être analysée par western blot. Steroid activité de liaison du GR immunoprécipité peut être déterminée par incubation de la immunopellet avec [3 H] stéroïdes.

Des expériences antérieures ont montré hsp90 médiée par l'ouverture de la liaison d'un ligand GR fissure nécessite hsp70, un chaperon moléculaire seconde également essentielle pour la viabilité des cellules eucaryotes. Activité biochimique de hsp90 et hsp70 sont catalysées par des co-chaperon Hop protéines, HSP40, et p23 5. Un chaperon machines multiprotéiques contenant hsp90, hsp70, Hop, et HSP40 endogène sont présents dans le cytoplasme des cellules eucaryotes, et lysat de réticulocytes fournit un chaperon riche source de protéines 6.

Dans la méthode présentée, GR est immunoadsorbed du cytosol des cellules et dépouillé de la machinerie chaperon hsp90/hsp70 endogènes en utilisant les conditions du sel doux. Le GR sel extrait est ensuite incubée avec réticulocytes lysat, l'ATP, et K +, ce qui aboutit à la reconstitution de la GR • hsp90 hétérocomplexe et la réactivation de l'activité de liaison des stéroïdes 7. Cette méthode peut être utilisée pour tester les effets de cofacteurs différents chaperon, de nouvelles protéines, et les inhibiteurs de HSP90 expérimentale ou GR afin de déterminer leur importance fonctionnelle sur hsp90 médiée stéroïdes 8-11 contraignant.

Protocol

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1. Préparation du cytosol des cellules contenant GR fonctionnelle

  1. Note technique: Tous les tampons doivent être réfrigérés et chaque étape de ce protocole, y compris les centrifugations et d'incubation, doit être effectuée sur la glace ou à 4 ° C, sauf indication contraire. La basse température est essentielle pour prévenir la dégradation des complexes GR et des protéines.
  2. En utilisant une centrifugeuse réfrigérée, obtenir un ~ 1-5 ml culot de cellules qui exprime une forte concentration de GR fonctionnelle. Exemples de sources de cellules riches en GR comprennent de fibroblastes de souris L929, qui expriment une forte concentration de GR endogène, et que les cellules Sf9 ont été infectées par un baculovirus recombinant GR (par exemple, le baculovirus p2Bac-MGR 12). Environ 15-20 ml de cellules emballée est obtenue par litre d'Sf9 culture cellulaire baculovirus. Les cellules doivent être en croissance exponentielle avant la récolte. Centrifuger la suspension cellulaire à 5000 g pendant 5 min.
  3. Laver le culot cellulaire à trois reprises avec 15 ml de Hanks solution saline tamponnée. Entre les lavages, doucement resuspendre le culot, suivie par une centrifugation à 5000 g pendant 5 min. Après le dernier lavage, retirez complètement le surnageant.
  4. Préparer 7,5 ml d'un tampon d'homogénéisation contenant un tampon HEM (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mM de molybdate de sodium, pH 7,4), 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), et 3 comprimés de-chaussée de inhibiteur de la protéase complète-Mini. Le PMSF et complètes Mini-tablettes de prévenir l'apparition de la protéolyse au cours des étapes ultérieures. Remplissez-Mini comprimés peuvent être facilement broyé en poudre fine avec un mortier et un pilon. Ajouter 1,5 volumes de tampon d'homogénéisation pour le culot cellulaire.
  5. Rupture des cellules par homogénéisation Dounce (50 coups) ou de gel / dégel (3 cycles) technique. Homogénéisation Dounce peut maintenir améliorée • GR endogène des complexes de protéines HSP90 et est plus rapide à remplir. Gel / dégel fournit chercheur une opportunité de suspendre le protocole à cette étape et continuer à une date ultérieure. Homogénéisation Dounce doit être effectuée avec l'homogénéisateur dans un seau à glace pour empêcher la dégradation des protéines. Gel / dégel peut être accompli par le gel du tube à centrifuger contenant la cellule mélange tampon pellets homogénéisation à l'azote liquide, glace sèche, ou -20 ° C d'incubation, suivie d'une décongélation dans un bain d'eau à 30 ° C.
  6. Séparez le cytosol GR-contenant de la matière particulaire des cellules rompues par ultracentrifugation. Transférer le broyat à des tubes d'ultracentrifugation durable, l'équilibre des tubes en masse dans les paires, et centrifuger à 100 000 g pendant 30 minutes.
  7. Retirez le cytosol (surnageant) et conserver à -20 ° C en aliquotes de 500 pl dans 1,5 ml pour microtubes stockage à long terme. Pour conserver le maximum de l'activité fonctionnelle GR, flash-geler les aliquotes dans de l'azote liquide ou incuber pendant 30 secondes dans un mélange méthanol-bain de glace sèche avant l'entreposage. Prenez garde à éviter tout contact cutané direct avec le réactif de refroidissement.

2. Immunoadsorption de GR à partir de cellules cytosol

  1. Note technique: La figure 2 présente un aperçu schématique des étapes 2-5 de ce protocole.
  2. Préparer un mélange contenant immunoadsorption une immunoglobuline monoclonale G (IgG) anticorps dirigé contre le GR à immunoadsorb le récepteur préparé à l'étape 1. Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 100 pi d'décongelés GR-cytosol contenant, 200 tampons TEGM ul (8 TES mm, 4 mM EDTA, 50 mM de NaCl, 20 mM de molybdate, 10% (v / v) glycérol, pH 7,6) , 100 ul d'une protéine de 20% A-Sépharose (PAS) g lisier (v / v, préparé dans un tampon de TEGM), et 5 de l'anti-GR IgG anticorps monoclonal (par exemple BuGR2). Molybdate est inclus dans le buffer TEGM afin d'aider à stabiliser le GR-hsp90 hétérocomplexe, qui peut être utile afin de endogènes hétérocomplexe dosage de l'activité contraignante stéroïdes 13.
    1. Anti-GR anticorps est disponible dans le commerce que la protéine purifiée. Alternativement, elle peut être obtenue en ajoutant 10 pl d'IgG anti-GR-ascite contenant le mélange immunoadsorption. L'ascite est produit par les souris injectées avec des cellules d'hybridomes anti-GR (par exemple FiGR hybridomes 14), et la concentration d'anticorps approximatifs obtenus à partir de l'ascite et utilisées dans ces expériences était de 0,5 pg / pl, telle que mesurée par dosage de Bradford.
    2. Préparer un échantillon témoin négatif en utilisant GR contenant cytosol, tampons TEGM, et PAS (comme décrit ci-dessus), et 5 pg d'une IgG qui ne reconnaît pas le GR, HSP90, ou d'autres protéines chaperons moléculaires (dénommé un «non immunes" anticorps).
    3. En raison de la taille relativement importante PAS perles, utilisez un coupe P-200 pipette lors du transfert de PAS de la bouillie de 20% à tubes échantillons. Couper embouts de pipettes sont préparés par tranchage de 2-3 mm de l'extrémité du commerce P-200 trucs, augmentant ainsi l'ouverture pipette.
  3. Placer les échantillons sur une roue en rotation verticale et incuber pendant un minimum de 2 heures avec une rotation constante. Les échantillons peuventêtre incubé pendant jusqu'à 8 heures sans perte d'activité.
  4. À la fin de l'incubation immunoadsorption, éliminer les protéines non lié de la pastille d'anticorps-PAS («immunopellet") par centrifugation. Séparez les surnageants immunopellets par centrifugation en utilisant une centrifugeuse réfrigérée programmé pendant 1 minute à 10 000 xg, puis laver deux fois avec une mémoire tampon TEGM ml et vortex. Après centrifugation et entre les lavages, éliminer le surnageant être prudent pour ne pas perturber le culot.
    1. Retirez toutes les surnageant à la conclusion de la deuxième lavage. Afin d'assurer qu'aucun des granulés est aspiré par inadvertance, utiliser un embout serti P-200 pipette d'aspiration surnageant final. Embouts de pipettes sertis sont préparés par l'aplatissement disponibles commercialement P-200 trucs aide de pinces.

3. La dissociation de Hsp90 endogène à partir de GR immunopellet ("Salt stripping")

  1. Pour l'immunopellet lavés préparée dans l'étape 2, ajouter 355 ul de tampon TEG (tampon TEGM sans molybdate de sodium) et 45 ul de 5 M de NaCl (concentration finale de NaCl = 0,5 M).
  2. Placer les échantillons sur une roue en rotation verticale et incuber pendant 1,5 heures avec une rotation constante. Les échantillons peuvent être mis à incuber pendant 2 heures, mais plus d'incubations peuvent aboutir à la récupération des protéines a diminué et baisse de l'activité fonctionnelle.
  3. Retirer protéines non de la immunopellet par centrifugation. Spin échantillons pendant 1 minute à 10000 x g. Laver une fois avec 1 ml de tampon TEG et une fois avec 1 ml de tampon Hepes 10 mM, pH 7,4.
  4. Retirez toutes les surnageant à la conclusion de la deuxième lavage, en faisant attention de ne pas perturber le immunopellet, en utilisant un P-200 serti pipette.

4. Reconstitution de GR • hsp90 hétérocomplexe utilisant chaperons moléculaires, des cofacteurs, et de l'ATP

  1. Note technique: Une myriade de conditions expérimentales peuvent être testés en incluant des protéines supplémentaires, des cofacteurs, des activateurs ou des inhibiteurs de l'intérêt dans le mélange de reconstitution préparé ci-dessous. Le volume total des mélanges de reconstitution doit être <120 pi.
  2. Pour chacun de sel-dépouillé immunopellet préparé à l'étape 3, ajoutez un mélange de reconstitution contenant 50 ul d'une source de chaperon moléculaire et 5 pi d'un système ATP génératrices (10 mM HEPES, 50 mM d'ATP, la créatine phosphate 250 mM, 20 mM d'acétate de magnésium , 100 de la créatine phosphokinase U / ml, pH 7,4).
    1. Reconstitution des réactions peut être augmenté en complétant le mélange de reconstitution avec 50 ul de tampon de HKD (10 mM HEPES, 100 mM de KCl, 5 mM dithiothréitol (DTT), pH 7,4) et un supplément de 5 l de l'ATP-système de production. Cette étape peut être omise si la reconstitution suffisante et contraignante stéroïdes sont observées. KCl augmente l'activité ATPase hsp70 et TNT protège cystéine contenant des protéines de l'oxydation 9.
    2. Une source chaperon recommandée moléculaire est disponible dans le commerce lysat de réticulocytes de lapin. Individuels chaperons moléculaires purifiés à partir de lysat de réticulocytes ou par recombinaison exprimées (par exemple 15 mg hsp90, hsp70 15 mg, 0,6 mg Hop, 6 mg p23, et 0,125 mg HSP40 en HKD tampon) peuvent également être utilisés.
  3. Incuber les échantillons dans un bain d'eau à 30 ° C pendant exactement 20 minutes. Tubes Flick toutes les 1-2 minutes, afin de perturber le culot doucement et mélanger la solution de reconstitution.
  4. Ajouter 1 ml de tampon TEGM, vortex et centrifuger à 10000 g pendant 1 minute. Retirez et jetez le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot. Répétez l'opération pour un total de trois lavages. Supprimer complètement tous surnageant à la fin du lavage final en utilisant une astuce serti P-200 pipette.

5. Analyse des complexes de protéines reconstituées et de l'activité de liaison au ligand

  1. Les protéines dans le reconstituée immunopellet peuvent être identifiés par l'électrophorèse en gel de polyacrylamide conventionnels dénaturantes (SDS-PAGE), l'électrophorèse microfluidique (par exemple, Bio-Rad Experion) et Western blot (Fig. 3). Note technique: Excellente protocoles décrivant SDS-PAGE 15 et Western blot 16 sont actuellement disponibles, gracieuseté d'autres chercheurs.
    1. Ajouter 50 ul de tampon d'échantillon SDS-PAGE contenant β-mercaptoéthanol et vortex. Spécifiques recettes tampon d'échantillon varient. Sélectionnez un élément basé sur la recommandation du fabricant du système d'électrophorèse d'être employé.
    2. Incuber pendant 5 minutes dans un bain d'eau bouillante ou 100 ° C de chaleur bloc électronique.
    3. Centrifuger à 10000 g pendant 1 minute. L'anticorps immunoadsorbing, GR, et des protéines complexées à des ressources génétiques seront dissociées les unes des autres et libérée dans le surnageant de tampon d'échantillon.
    4. Transférer le surnageant dans un microtube frais en utilisant une pointe serti pointe P-200 pipette. Jeter le culot. L'échantillon est maintenant prêt pour l'analyse de l'aide disponible dans le commerce SDS-PAGE ou systèmes d'électrophorèse microfluidique. Remplissez f soit la techniqueuite aux instructions du fabricant.
    5. Western blot suivantes SDS-PAGE permet une identification définitive de la GR et les chaperons moléculaires immunoadsorbed complexé à la GR après incubation de reconstitution. Utilisez des anticorps monoclonaux dirigés contre primaires GR (BuGR2), hsp90 (AC88), hsp70 (N27F3-4) et co-chaperon de protéines pour détecter les principaux éléments de la GR complexes protéines HSP90 •.
  2. L'activation fonctionnelle de la GR sel dépouillés suivant la reconstitution de la GR complexes protéines HSP90 • peuvent être identifiés par le dosage de l'activité de liaison des stéroïdes en utilisant un [3 H] stéroïdes (fig. 4). Pour le reste du protocole, suivez les précautions nécessaires pour la manipulation sécuritaire des échantillons tritiés et des déchets.
    1. Pour l'immunopellet reconstitué, ajouter 47,5 tampon HEM ul et 2,5 pi de 2 pM [3 H] dexaméthasone (concentration finale de stéroïdes = 100 nM).
    2. Mélanger délicatement le culot en veillant à minimiser la quantité d'échantillon déplacées à la paroi du tube de microcentrifugeuse.
    3. Incuber une nuit sur la glace. Il n'est pas nécessaire de tourner ou mélanger les tubes d'échantillons pendant cette incubation.
    4. Ajouter 1 ml de tampon TEGM, mélanger délicatement et centrifuger à 10000 g pendant 1 minute. Jeter le surnageant, en étant conscient qu'il contient non liés [3 H] stéroïdes. Répétez l'opération pour un total de 3 lavages avec le tampon TEGM.
    5. Supprimer complètement tous surnageant à la fin du lavage final en utilisant une astuce serti P-200 pipette. Le culot contient GR, hsp90 et d'autres chaperons moléculaires complexé à la GR, et le [3 H] stéroïdes spécifiquement lié au récepteur. La liaison non spécifique peut être calculée en incluant 1000 fois supérieur non tritiée dexaméthasone dans le mélange une nuit d'incubation. Comme une alternative de contrôle négatif, l'anticorps anti-GR immunoadsorbing ajouté à l'étape 2.2 peut être remplacé par un non-GR-immunoadsorbing anticorps (NI).
    6. Suspendre le immunopellets lavés dans 200 ul de tampon TEGM et le transfert de 10 flacons de scintillation ml en utilisant un coupe P-200 pipette.
    7. Ajouter 4,8 ml d'un cocktail de scintillation des flacons et des vortex.
    8. Le montant de [3 H] contraignante de stéroïdes pour le GR reconstitué complexes protéines HSP90 • peuvent être dosés par spectrométrie à scintillation liquide.

6. Les résultats représentatifs:

Représentant SDS-PAGE et Western blot des données sont présentées dans la figure 3. Le GR endogène • hsp90 hétérocomplexe est immunoadsorbed du cytosol cellulaire utilisant des anticorps anti-GR anticorps et des protéines individuelles que la co-immunoadsorb avec le GR sont visualisés par coloration au bleu de Coomassie (figure 3A). Confirmation de l'identité des protéines de tout composant de l'immunopellet à n'importe quelle étape dans le dosage de la reconstitution peut être fait par SDS-PAGE calcul du poids moléculaire et Western blot utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine d'intérêt.

GR reconstitués • hsp90 hétérocomplexes sont présentés en utilisant les données Experion électrophorèse microfluidique (fig. 3C et 3D) et l'analyse western blot (figure 3B). La spécificité de l'immuno-GR est confirmée en remplaçant le immunoadsorbing anti-GR anticorps avec un anticorps non immuns (Fig. 3C, NI voies IgG). Même lorsque des quantités excessives d'anticorps non immunisées sont utilisées, sans chaperons moléculaires sont GR ou immunoprécipité (cf. Fig. 3C, le GR, hsp90 et hsp70 bandes de protéines présentes dans les ruelles immunoadsorption anti-GR avec le manque de bande observée dans le NI voies IgG). De même, il est possible de confirmer la dissociation des protéines chaperons Hsp90 et d'autres de la GR sel dépouillé par analyse western blot (figure 3B) de l'immunopellets démembrés et reconstitués. La chaîne lourde de l'anticorps immunoadsorbing (HC) est détectable par les deux Coomassie taches et Western blot, et il sert à confirmer l'égalité immunopellets taille sont visualisés dans chaque couloir.

Steroid activité de liaison du GR immunoadsorbed peuvent être analysés par l'ensemble des conditions testées, et le représentant de stéroïdes liaison de données sont présentées dans la figure 4. GR endogène • hsp90 hétérocomplexes sont immunoadsorbed, sel dépouillé, et reconstitué. En utilisant soit lysat de réticulocytes ou des protéines purifiées, stéroïdes activité de liaison de la GR reconstitué • hsp90 hétérocomplexe renvoie généralement à 75-100% de la GR endogène • hsp90 niveau de l'activité de liaison. Similaires aux données d'électrophorèse, un anticorps non immuns (NI) peut être utilisé à la place de l'anticorps anti-GR (I) dans le but de servir de témoin négatif et comme une mesure de non-spécifiques [3 H] contraignante stéroïdes.

Figure 1
Figure 1. Modèle de GR • Assemblée hétérocomplexe hsp90 et GR stéroïdes ouverture contraignante palatine. La machinerie chaperon hsp90/hsp70-based convertit le domaine ligand GR contraignante à partir d'un suila conformation du DED dans lequel la liaison des stéroïdes fente est fermée et ne sont pas accessibles à l'hormone d'une conformation ouverte fente qui peut être consulté (illustré par l'icône hétérocycliques stéroïde). La machinerie chaperon est prémonté dans la cellule et se former spontanément une fois purifié hsp90, hsp70, et Hop sont mélangés en solution (réaction 1). Hop contient un 34 répétez aminés tetratricopeptide acide (TPR) domaine (illustré comme un croissant noir), et est plus tard remplacé pendant le processus de maturation hétérocomplexe par un domaine contenant des protéines immunophiline TPR. Les machines ouvre la liaison des stéroïdes fissure dans une ATP-et K +-dépendante, après quoi Hop et la plupart des HSP70 et HSP40 finalement quitter le complexe (illustré par une icône en pointillés). Mécaniste, hsp70 interagit avec le GR avant Hsp90 et amorce le récepteur de hsp90 et après l'ouverture palatine. Expérimentalement, la fixation des stéroïdes et de l'ouverture GR-lièvre sont augmentés si Hsp90 et hsp70 sont présents simultanément. Le hétérocomplexe est stabilisé par l'entrée de l'hsp90 co-chaperon p23, qui maintient hsp90 dans une conformation ATP-lié. Après la sortie de Hop, un haut poids moléculaire immunophiline (IMM) peuvent se lier hsp90, formant le hétérocomplexe final tel qu'il est récupéré à partir des cellules. Adapté de Pratt et Toft 1.

Figure 2
Figure 2. Représentation schématique des étapes 2-5 de ce protocole. La GR est immunoadsorbed du cytosol des cellules en utilisant un anticorps monoclonal dirigé contre le GR (FiGR) lié à un culot de protéine A-Sépharose. Hsp90 et d'autres protéines chaperons présentes dans le GR endogène • hsp90 hétérocomplexe sont co-immunoadsorbed avec le GR, et le GR est capable de se lier à des stéroïdes. Hsp90 est dissociée de GR en utilisant un traitement au sel doux, appelé sel de décapage (Str). La liaison des stéroïdes creux du sel dépouillé GR ferme, ce qui rend incapable de se lier aux stéroïdes. • GR intermédiaire hsp90 hétérocomplexes contenant Hsp70, HSP40, et hop, qui sont capables de liaison des stéroïdes, peut être reconstituée (Recon), en incubant le sel dépouillé GR avec des protéines purifiées ou lysat de réticulocytes (Retic lysat) et cofacteurs. L'activité de liaison des stéroïdes et de la teneur en protéines immunopellet de chaque étape peuvent être identifiés par nuit [3 H] d'incubation de stéroïdes et Western blot, respectivement.

Figure 3
Figure 3. Analyse des protéines par électrophorèse des complexes immunoadsorbed. A, SDS-PAGE des GR reconstitué • hsp90 hétérocomplexe imagée en utilisant le système d'électrophorèse conventionnelle suivie par électrotransfert et coloration au bleu de Coomassie. En plus de GR, hsp90, hsp70 et de la chaîne lourde (HC) et la chaîne légère (CL) de l'anticorps sont visualisés. La migration des marqueurs de poids moléculaire (exprimée en kDa) sont indiqués sur la gauche. B, Western blot de immunopellets contenant sel dépouillé GR (Str) et GR reconstitué • hsp90 hétérocomplexe (Recon). C, un gel virtuel de GR reconstitué • hsp90 hétérocomplexe généré en utilisant un système Experion électrophorèse microfluidique. Deux concentrations différentes d'un non immuns (NI IgG) et immunitaire (anticorps anti-GR) immunoadsorbing anticorps sont inclus. IgG NI servent de témoins négatifs. D, GR électrophérogramme d'reconstitué • hsp90 obtenus à partir de l'échantillon hétérocomplexe Experion électrophorèse microfluidique montré dans la troisième voie de B. Avantages panel d'électrophorèse microfluidique comprennent l'exigence pour les volumes plus petits, une diminution de la manipulation de liquides et après la course de nettoyage, une meilleure quantification, et de façon substantielle plus courte de l'échantillon s'exécute.

Figure 4
Figure 4. Stéroïdes activité de liaison de immunopellets suivantes immunoadsorption du GR endogène (Enodg), sel, dépouillé GR (Str) et reconstitué GR • hsp90 hétérocomplexe (Recon). En plus de immunoadsorbing le GR avec un anticorps monoclonal anti-GR anticorps immunoadsorbing (I), des échantillons de contrôle négatif pour chaque condition ont été préparés en utilisant une immunoglobuline non immuns (NI).

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Discussion

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L'essai décrit ci-dessus peut être adapté pour tester une multitude de conditions affectant les actions de la machinerie chaperon chaperon hsp90/hsp70-based ainsi que GR contraignante stéroïdes. Il s'agit d'une modification des méthodes précédemment rapporté 4,8,9,17 et est conçu pour tirer profit des progrès récents dans la technologie d'électrophorèse et être accessible à une communauté plus large de recherche. Cofacteurs supplémentaires ou des protéines d'intérêt peut être ajouté à la GR • hsp90 mélange de reconstitution hétérocomplexe, décrit dans l'étape 4 du protocole, afin d'observer les effets sur stéroïdes contraignant, hétérocomplexe interactions protéine-protéine, et co-facteur de besoins. Par exemple, les effets de l'ischémie-reperfusion sur la fonction hsp90 peut être modélisé par l'ajout de concentrations croissantes d'une des espèces oxygénées réactives. Les protéines purifiées avec une fonction spécifique (par exemple hsp90 acétylée) ou le potentiel des inhibiteurs de HSP90 (analogues par exemple geldanamycine roman) peuvent être ajoutés pour que leurs effets sur la formation obligatoire et hétérocomplexe stéroïdes à déterminer.

En aval des dosages différents de l'électrophorèse, Western Blot, et des dosages de liaison des stéroïdes peuvent également être employés. Par exemple, des complexes multiprotéiques immunoprécipitées ont été analysées par cytométrie de flux avec des succès substantiels 18,19. Le GR immunoadsorbed • hsp90 complexes peuvent également être analysés pour l'Etat ou de nucléotides hsp90/hsp70 visualisés en utilisant la microscopie à force atomique 17. Hsp90 protéines clientes autres que le GR peut être utilisé (par exemple chaperoning kinase checkpoint I (Chk1) 20), et la recherche séminale a été réalisée en utilisant des variantes de ce protocole avec les récepteurs des œstrogènes, récepteur de la progestérone, et Src 1,13,21.

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Disclosures

Sélectionnez réactifs d'électrophorèse et des logiciels d'analyse d'images ont été fournies par Bio-Rad.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé accorde GM086822, Hope Institut de cardiologie de sciences fondamentales prix, et le MJ Murdock Charitable Trust Collège programme de recherche scientifique. Sélectionnez réactifs d'électrophorèse et des logiciels d'analyse d'images ont été généreusement offerts par Bio-Rad.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 insect cells Invitrogen for baculovirus expression of recombinant mouse GR
L929 cells ATCC CRL-2173 for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression)
FiGR hybridoma cells ATCC CRL-2173 for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody)
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free Roche Group 11836170001
protein A-Sepharose Sigma-Aldrich P3391
rabbit reticulocyte lysate Green Hectares (Oregon, WI) rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery
creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C3755 for ATP-regenerating system
phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936 for ATP-regenerating system
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) Pierce, Thermo Scientific MA1-510 used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) Enzo Life Sciences ADI-SPA-830 used as primary antibody in western blotting
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) Enzo Life Sciences ADI-SPA-820 used as primary antibody in western blotting
IgG from mouse serum Sigma-Aldrich 038K7690 used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate Sigma-Aldrich A4416 used as secondary antibody in western blotting
Experion microfluidic electrophoresis system Bio-Rad 7007001 alternative to conventional SDS-PAGE
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone PerkinElmer, Inc. NET1192001MC follow safety precautions

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
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Reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines Hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand
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Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).More

Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).

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