Summary
Abstract
Hsp90은 세포 자전거에 관련된 전사 인자 (예 : 핵 수용체, p53의)와 단백질 kinases (예 : SRC, RAF, Akt 키나제)를 포함한 150 개 이상의 진핵세포 신호 단백질을 조절하는 것으로 판명되었습니다 순수하고 매우 풍부한 분자 보호자 역할 단백질입니다 tumorigenesis, apoptosis, 여러 진핵세포 신호 경로 1,2. hsp90 이러한 다양한 '고객'단백질의 스테로이드 수용체의 조립 • hsp90 단지는 (그림 1) 정의 가장됩니다. 우리는 여기서 적응 글루코 코르티 코 이드 수용체 (GR) immunoprecipitation 분석과 쉽게 진핵세포 hsp90 기능 활동, 바인딩 hsp90 - 중재 스테로이드 수용체 리간드 및 분자 보호자 역할 cofactor 요구 사항을 탐사하는 데 사용할 수 있습니다 체외 GR에 • hsp90 reconstitution 방법을 제시한다. 예를 들어,이 분석은 hsp90 cofactor 요구 사항 및 reconstitution 과정 외인성 화합물을 추가의 효과를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
수용체는 스테로이드 3 액세스할 수 있습니다 분열 오픈 리간드 바인딩을 hsp90에 바인딩해야하기 때문에 GR은 hsp90를 공부에 특히 유용 시스템되었습니다. 내생, unliganded GR은 noncovalently hsp90에 바인딩 포유 동물 세포의 세포질에 존재합니다. 이름으로 내생 GR • hsp90 heterocomplex에서 발견, 갈라진 GR의 리간드 바인딩은 개방적이고 구속력 스테로이드 가능합니다. hsp90 GR에서 dissociates 또는 그 기능이 저해되면 수용체는 스테로이드 구속 수 있으며, 스테로이드 구속력이 활동을하기 전에 GR • hsp90 heterocomplex의 reconstitution을 필요로 4를 복원하는 경우. GR은 단클론 항체를 사용하여 셀 cytosol에서 immunoprecipitated, 그리고 서양 얼룩에 의해 assayed 수있는 등 hsp90와 같은 단백질은 GR에 complexed 수 있습니다. immunoprecipitated GR의 스테로이드 결합 활동은 [3 H] 스테로이드와 immunopellet을 잠복기에 의해 결정하실 수 있습니다.
이전 실험 분열 GR의 리간드 바인딩의 hsp90 - 중재 열기를 보이고있다하면 진핵 세포 생존을위한 hsp70, 두 번째 분자 보호자도 중요합니다. hsp90 및 hsp70의 생화 학적 활동이 공동 보호자 역할 단백질의 홉, hsp40, 그리고 p23 5 촉매 있습니다. hsp90, hsp70, 타, 그리고 hsp40를 포함하는 multiprotein의 보호자 기계는 진핵 세포 세포질에 endogenously 존재하고 있으며, reticulocyte lysate는 보호자 풍부한 단백질 소스 여섯를 제공합니다.
표시 방법에서 GR은 셀 cytosol에서 immunoadsorbed하고 온화한 소금 조건을 사용하여 내생 hsp90/hsp70 보호자 기계 찟겼어. 소금 막았죠 GR은 다음 GR의 reconstitution 결과 reticulocyte lysate, ATP, 그리고 K +와 incubated입니다 스테로이드 바인딩 활동 7 • hsp90 heterocomplex 및 재활 성화. 이 방법은 hsp90 - 중재 스테로이드 결합 8-11 그들의 기능 중요성을 결정하기 위해 다양한 보호자 역할 cofactors, 소설의 단백질, 그리고 실험 hsp90 또는 GR 억제제의 효과를 테스트하기 위해 이용하실 수 있습니다.
Protocol
1. GR 기능을 포함하는 세포의 cytosol 준비
- 기술 참고 : 모든 버퍼는 냉장되어야하며 centrifugations과 부화를 포함하여이 프로토콜의 각 단계가 얼음이나 4 수행해야합니다 별도의 언급이없는 한 ° C. 낮은 온도는 GR과 단백질 단지의 저하를 방지하기 위해 필수적입니다.
- 냉장 원심 분리기를 사용하여 기능 GR의 높은 농도를 표현 세포 ~ 1-5 ML 펠렛을 구하십시오. GR 풍부한 세포 소스의 예로는 마우스 fibroblast 내생 GR의 높은 농도를 표현 L929 세포, 그리고 재조합 GR의 baculovirus (예 : p2Bac - mGR baculovirus 12)에 감염되었을 Sf9 세포를 포함합니다. 포장 세포의 약 15-20 ML은 Sf9 baculovirus 셀 문화의 리터 당 얻을 수 있습니다. 세포는 이전에 수확에 기하 급수적으로 증가한다. 5 분 5,000 × g에서 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 행크스 '버퍼 생리 식염수 15 ML과 세포 펠렛을 세 번 씻으십시오. 세척 사이에, 부드럽게 5 분 5,000 centrifuging 다음 펠렛, × g을 resuspend. 마지막 세척 후, 완전히 뜨는을 제거합니다.
- 앙 버퍼 (10 MM의 HEPES, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 나트륨 molybdate, 산도 7.4), 1 ㎜의 phenylmethylsulfonyl 플루오르 (PMSF), 그리고 완료 - 미니 테아제 억제제 3 지상 위패를 포함하는 균질화 버퍼의 7.5 ML를 준비합니다. PMSF과 완전한 - 미니 타블렛은 이후 단계 동안 발생 proteolysis되지 않습니다. 완료 - 미니 타블렛 쉽게 절구와 유봉과 함께 훌륭한 분말 그라운드 수 있습니다. 세포 펠렛으로 균질화 버퍼의 1.5 볼륨을 추가합니다.
- 파열 Dounce의 균질화 (50 치기) 또는 동결 / 해동 (3주기) 기술에 의해 세포. Dounce의 균질 향상 내생 GR • hsp90 단백질 단지를 유지하고 완료하기 위해 빠릅니다 수 있습니다. 고정 / 해동이 연구원이 단계에서 프로토콜을 중단하고 나중에 계속 기회를 제공합니다. Dounce의 균질은 단백질 저하를 방지하기 위해 얼음 양동이에있는 균질 화기로 수행하여야한다. 고정 / 해동이 액체 질소, 드라이 아이스, 또는 -20로 펠릿 - 균질화 버퍼 혼합 세포를 포함하는 원심 튜브를 동결하여 수행할 수 있습니다 ° C 30 ° C 물 욕조에서 해동 다음 부화.
- ultracentrifugation에 의해 파열 세포 미립자 물질의 GR - 포함된 cytosol 구분합니다. 30 분 100,000 × g에서 내구성 초원 심 분리기 튜브, 쌍에 대량으로 균형 튜브와 원심 분리기에 homogenate을 전송합니다.
- 장기 저장을위한 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 500 μl aliquots에서 -20에서 cytosol (뜨는) 및 저장 ° C를 제거합니다. 최대 기능 GR 활동을 유지하려면, 이전에 저장하기 위해 메탄올 - 드라이 아이스 욕조에서 30 초 동안 액체 질소 또는 부화에 aliquots을 플래시 동결. 냉각 시약과 직접 피부 접촉을 피하기 위해주의를 가져가라.
2. 휴대 cytosol에서 GR의 Immunoadsorption
- 기술 참고 : 그림 2는이 프로토콜의 단계 2-5의 구조 개요를 제공합니다.
- 1 단계에서 준비 수용체를 immunoadsorb하는 GR에 대해 제기된 단클론 면역 글로불린 G (IgG) 항체를 포함하는 immunoadsorption 혼합물을 준비합니다. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 해동 100 μl GR - 포함된 cytosol, 200 μl TEGM 버퍼를 (8 당연 TES, 4 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 50 MM NaCl, 20 MM의 molybdate, 10 % (V / V) 글리세롤, 산도 7.6) 결합 , 20 % 단백질의 100 μl A - 세파 로스 (PAS) 안티 GR 단클론 IgG 항체의 슬러리 (V / V, TEGM 버퍼에서 준비), 5 μg (예 : BuGR2). Molybdate는 분석 내생의 heterocomplex 스테로이드 바인딩 작업 13을 위해 도움이 될 수있는 GR - hsp90 heterocomplex을 안정에 도움이하기 위해 TEGM 버퍼에 포함되어 있습니다.
- 안티 GR 항체는 단백질을 정제로 상업적으로 사용할 수 있습니다. 또는, 그것은 immunoadsorption 혼합물에 반 GR IgG 함유 복수 10 μl를 추가하여 얻을 수 있습니다. 복수는 안티 - GR 하이 브리 도마 세포 (예 : 하이 브리 도마 세포 FiGR 14)와 함께 주입 생쥐에 의해 생산, 그리고 복수에서 얻은 이러한 실험에 사용되는 대략적인 항체 농도는 브래드 포드 분석에 의해 측정, 0.5 μg / μl였다.
- GR - 포함된 cytosol, TEGM 버퍼, 그리고 PAS (위에서 설명한 것처럼) 및 GR를 인식하지 못합니다 IgG 5 μg, hsp90, 또는 다른 분자 보호자 역할 단백질 ( "nonimmune"라고 사용하여 대조군 샘플 준비 항체).
- 샘플 튜브에 20 % 슬러리에서 PAS를 전송할 때 비교적 큰 PAS 비드 크기 때문에 절단에게 P - 200 pipet 팁을 사용합니다. 컷 pipet 팁 그러므로 pipet 팁 조리개를 증가, 상용 P - 200 팁 끝에 2-3하셔야 잘라 내서으로 준비하고 있습니다.
- 일정한 회전 2 시간의 최소 수직 회전 바퀴와 부화에 장소 샘플. 샘플 수활동의 손실없이 최대 8 시간 동안 incubated 수 있습니다.
- immunoadsorption 보육의 결론에서 원심 분리하여 항체 - PAS 펠릿 ( "immunopellet")에서 언바운드 단백질을 제거합니다. 10,000에서 1 분 프로그램 냉장 원심 분리기 × g를 사용하는 원심 분리하여 immunopellets에서 supernatants을 분리하고, 다음 1 ML의 TEGM 버퍼와 소용돌이와 함께 두 번 씻는다. 원심 분리와 세척 사이에 다음의 펠렛을 방해하지 않도록 신중 뜨는 폐기하십시오.
- 두 번째 세척 끝 부분에서 모든 표면에 뜨는를 제거합니다. 펠렛의 아무도가 실수로 aspirated되지 않도록하기 위해, 최종 뜨는 흡인에 대한 방해하는 P - 200 pipet 팁을 사용합니다. 곱슬 곱슬하게지지는 pipet 팁은 집게를 사용하여 상용 P - 200 도움말 납작하여 준비가되어 있습니다.
3. GR immunopellet에서 내생 hsp90의 분리 ( "소금 스트립")
- 2 단계에서 준비한 씻어 immunopellet하려면, 355 μl TEG 버퍼 (나트륨 molybdate없이 TEGM 버퍼) 5 M NaCl (최종 NaCl 농도가 = 0.5 M) 45 μl를 추가합니다.
- 일정한 회전 1.5 시간 동안 수직 회전 바퀴와 부화에 장소 샘플. 샘플은 최대 2 시간 동안 incubated 수 있지만, 더 이상 incubations 감소 단백질 복구 및 낮은 기능 활동 발생할 수 있습니다.
- 원심 분리하여 immunopellet에서 언바운드 단백질을 제거합니다. 10,000 × G.시 1 분 샘플을 스핀 1 ML TEG 버퍼와 한번 10 MM의 HEPES 버퍼, 산도 7.4의 1 ML과 함께 한 번 씻으십시오.
- 두 번째 세척 끝 부분에서 모든 표면에 뜨는를 제거 immunopellet을 방해하지 않도록주의하고, 곱슬 곱슬하게지지는 P - 200 pipet 팁을 사용합니다.
4. GR의 Reconstitution 분자 보호자, cofactors, 그리고 ATP를 사용하여 • hsp90 heterocomplex
- 기술 참고 : 실험 조건의 무수한 아래 준비 reconstitution 혼합물에 추가 단백질, cofactors, activators, 또는 관심 억제제를 포함하여 테스트하실 수 있습니다. reconstitution의 혼합물의 총 부피는 <120 μl해야합니다.
- 각 소금 막았죠 immunopellet는 분자 보호자 역할 소스와 ATP 생성 시스템 (10 MM의 HEPES, 50 MM ATP, 250 MM의 크레아틴 인산, 20 MM 마그네슘 아세트산 5 μl의 50 μl를 포함하는 reconstitution 혼합물을 추가, 3 단계에서 준비 , 100 U / ML 크레아틴 phosphokinase, 산도 7.4).
- Reconstitution 반응은 50 μl HKD 버퍼 (10 MM의 HEPES, 100 MM KCl, 5 MM dithiothreitol (DTT), 산도 7.4)와 ATP 생성 시스템의 추가 5 μl와 reconstitution 혼합물을 보완 증가 수 있습니다. 넓은 reconstitution와 스테로이드 구속력이 관찰하는 경우이 단계는 생략할 수 있습니다. KCl은 hsp70 ATPase 활동을 증가하고 DTT는 시스테인 함유 산화 9 단백질을 보호합니다.
- 추천 분자 보호자 역할 소스는 상용 토끼 reticulocyte lysate에 있습니다. 개별 분자 보호자는 reticulocyte lysate에서 정화 또는 recombinantly 표현 (예 : 15 μg hsp90, hsp70 15 μg, 0.6 μg의 홉, 6 μg p23, 그리고 0.125 HKD 버퍼에 μg hsp40)도 사용할 수 있습니다.
- 정확히 20 분 동안 30 ° C의 물을 욕조에 샘플을 품어. 영화 튜브는 순서에있는 모든 1~2분 부드럽게 펠렛을 방해하고 reconstitution 솔루션을 혼합합니다.
- 1 분 만 1 ML TEGM 버퍼, 소용돌이, 그리고 원심 × g을 추가합니다. 뜨는을 제거하고 펠렛을 방해하지 않도록주의하고 폐기. 세 세척의 총 반복합니다. 완전히 방해하는 P - 200 pipet 팁을 사용하여 최종 세척 끝 부분에서 모두 뜨는을 제거합니다.
5. 재구성 단백질 합성물과 리간드 바인딩 활동 분석
- 재구성 immunopellet의 단백질은 종래의 denaturing polyacrylamide 겔 전기 영동 (SDS - PAGE), microfluidic 전기 (예 : 생물 RAD Experion) 및 (그림 3) blotting 서양에서 확인할 수 있습니다. 기술 참고 : SDS - PAGE 15 16 blotting 서양을 설명하는 탁월한 프로토콜은 현재 다른 조사의 호의 사용할 수 있습니다.
- β - 메르 캅 토 에탄올과 소용돌이를 포함한 SDS - PAGE 샘플 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 특정 샘플 버퍼 요리법 다릅니다. 고용하는 전기 시스템의 제조 업체의 권고에 따라 하나를 선택합니다.
- 끓는 물에 목욕 또는 100 ° C 전자 열 블록에서 5 분 알을 품다.
- 1 분 10,000 × g에서 원심 분리기. GR에 complexed immunoadsorbing 항체, GR, 그리고 단백질 하나를 dissociated하고 샘플 버퍼 뜨는로 발표합니다.
- 곱슬 곱슬하게지지는 팁 P - 200 pipet 팁을 사용하여 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. 펠렛 폐기하십시오. 샘플은 현재 상용 SDS - PAGE 전기 영동 또는 microfluidic 시스템을 사용하여 분석을위한 준비가되어 있습니다. 기술의 F 중 하나를 완료제조 업체의 지시를 따르게.
- SDS - PAGE를 다음과 서양 얼룩 분석 immunoadsorbed GR과 reconstitution 보육 다음 GR에 complexed 분자 보호자의 확실한 식별을 허용합니다. GR • hsp90 단백질 복합의 주요 구성 요소를 감지하는 단클론 기본 GR (BuGR2), hsp90 (AC88)에 대해 제기 항체, hsp70 (N27F3 - 4)와 공동 보호자 역할 단백질을 사용합니다.
- • hsp90 단백질 복합은 [3 H] 스테로이드 (그림 4)를 사용하여 스테로이드 바인딩 활동을 시금하여 확인할 수 있습니다 GR의 reconstitution 다음 소금 막았죠 GR의 기능 활성화. 프로토콜의 나머지 부분에 대한, 안전 tritiated 샘플 및 폐기물 처리에 필요한주의 사항을 따르십시오.
- 재구성 immunopellet하려면, 47.5 μl 앙 버퍼 2 μm의 2.5 μl [3 H] dexamethasone (최종 스테로이드 농도 = 100 nm의)을 추가합니다.
- 부드럽게 microcentrifuge 관의 벽에 있질 샘플의 양을 최소화하기 위해주의되는 펠렛을 섞는다.
- 얼음 밤새 품어. 이것이 부화하는 동안 샘플 튜브를 회전하거나 혼합 필요가 없습니다.
- 10,000 1 ML의 TEGM 버퍼, 부드럽게 믹스, 그리고 원심 × 1 분 g을 추가합니다. 염두되고, 표면에 뜨는를 버리고 그것은 언바운드 [3 H] 스테로이드가 포함되어 있습니다. TEGM 버퍼 3 지워지 총 반복합니다.
- 완전히 방해하는 P - 200 pipet 팁을 사용하여 최종 세척 끝 부분에서 모두 뜨는을 제거합니다. 펠렛은 GR, GR에 complexed hsp90 및 기타 분자 보호자와 [3 H] 스테로이드 특별히 수용체에 바인딩이 포함되어 있습니다. 특이 현상이 바인딩은 하룻밤 배양 혼합 1000 배 초과하지 않는 tritiated dexamethasone 포함하여 계산하실 수 있습니다. 다른 대조군으로서, 안티 - GR immunoadsorbing 항체가로 대체될 수 있습니다 단계 2.2에 추가되지 않은 GR - immunoadsorbing 항체 (NI)를.
- 200 μl TEGM 버퍼와 절단 P - 200 pipet 팁을 사용하여 10 ML의 섬광 튜브로 전송에 씻어 immunopellets을 일시 중지합니다.
- 유리병과 소용돌이에 4.8 ML의 섬광 칵테일을 추가합니다.
- [3 H] 재구성 GR에 스테로이드 바인딩의 양은 • hsp90 단백질 복합은 액체 섬광 분광 분석을 사용하여 assayed 수 있습니다.
6. 대표 결과 :
대표 SDS - PAGE와 서양 얼룩 데이터는 그림 3에서 제공됩니다. 내생 GR은 • hsp90 heterocomplex는 안티 - GR 항체와 GR 공동 immunoadsorb은 Coomassie의 얼룩 (그림 3A)에 의해 시각되는 각각의 단백질을 사용하여 셀 cytosol에서 immunoadsorbed 있습니다. reconstitution 분석의 모든 단계에서 immunopellet의 모든 구성 요소의 단백질 정체성의 확인은 관심의 단백질에 대한 단클론 항체 제기를 사용하여 분자량과 서양 blotting의 SDS - PAGE 계산에 의해 만들 수 있습니다.
재구성 GR은 • hsp90 heterocomplexes는 Experion microfluidic 전기 영동 데이터 (그림 3C 및 3D)과 서양 얼룩 분석 (그림 3B)를 사용 제공됩니다. GR immunoadsorption의 특이성은 nonimmune 항체 (그림 3C, NI IgG의 차선)와 immunoadsorbing 방지 GR 항체를 대체하여 확인됩니다. nonimmune 항체의 과도한 금액을 사용하는 경우에도, 아무 GR 또는 분자 보호자는 (그림. 3C에서 참조하라, GR, hsp90과에서 관찰 밴드의 부족과 방지 GR immunoadsorption의 차선에있는 hsp70 단백질 밴드 immunoprecipitated 없습니다 NI IgG의 차선). 마찬가지로, 그것은 옷을 벗긴 채 재구성 immunopellets 서양 얼룩 분석하여 소금 막았죠 GR (그림 3B)에서 hsp90의 분해 및 기타 보호자 역할 단백질을 확인 할 수 있습니다. immunoadsorbing 항체의 중쇄 (HC)는 Coomassie 얼룩과 blotting 서양 모두에 의해 감지되며, 각 차선 시각되고 동일한 크기의 immunopellets을 확인하는 역할을합니다.
immunoadsorbed GR의 스테로이드 결합 활동이 테스트의 모든 조건에 의해 assayed 수 있으며, 대표적인 스테로이드 데이터 바인딩은 그림 4에 표시하고 있습니다. 내생 GR은 • hsp90 heterocomplexes는 immunoadsorbed, 소금 막았죠하고, 재구성하고 있습니다. 중 reticulocyte lysate를 사용하거나 단백질 투석을, 재구성 GR의 스테로이드 결합 활동 • hsp90 heterocomplex 일반적으로 내생 GR • hsp90 바인딩 활동 수준의 75~100%로 돌아갑니다. 전기 데이터와 마찬가지로, nonimmune 항체 (NI)는 부정적인 제어 역할을하기 위해와 특이 현상 [3 H] 스테로이드 바인딩의 조치로 안티 - GR 항체 (I) 대신 사용할 수 있습니다.
그림 1. GR • hsp90 heterocomplex 어셈블리 및 GR 스테로이드 바인딩 분열 개방의 모델입니다. hsp90/hsp70-based 보호자의 기계 fol에서 GR의 리간드 바인딩 도메인을 변환갈라진 스테로이드 바인딩이 닫히고 (헤테로 스테로이드 아이콘 그림)에 액세스할 수 있습니다 오픈 갈라진 형태로 호르몬에 액세스할 수 없다는있는 됐나요 형태. 보호자 기계는 셀에 preassembled하고 hsp70 hsp90을 정화하면 자발적으로 형성되며, 타은 (반응 1) 용액에 혼합하고 있습니다. 홉는 34 아미노산 tetratricopeptide 반복 (TPR) 도메인 (검은 초승달 같은 삽화가)가 포함되어 있으며, 나중에 TPR 도메인 함유 immunophilin 단백질에 의해 heterocomplex의 성숙 과정에서 대체됩니다. 기계가 타와 hsp70과 hsp40 궁극적으로 대부분의 떠나 그 이후, ATP 및 K + 종속적인 방식으로 갈라진 스테로이드 바인딩을 여는 복잡한 (점선 아이콘으로 그림). Mechanistically, hsp70는 hsp90에 대한 수용체 이후 쪼개진 개방을 hsp90하기 전에 GR와 상호 작용하고 primes. hsp90과 hsp70이 동시에 존재하는 경우 실험적으로, 스테로이드 바인딩 및 GR 분열 개방이 증가하고 있습니다. heterocomplex는 ATP - 바운드 형태의 hsp90을 유지 hsp90 공동 보호자 역할 p23의 항목이 안정화됩니다. 홉의 출구 후, 높은 분자량 immunophilin (IMM)은 그것이 세포의 복구와 같이 최종 heterocomplex을 형성, hsp90를 바인딩할 수 있습니다. 프랫과 가옥과 대지 1 적응.
그림 2.이 프로토콜의 단계 2-5의 도식 표현. GR은 단백질 A - 세파 로스의 펠렛에 바인딩된 GR (FiGR)에 대해 제기된 단클론 항체를 사용하여 셀 cytosol에서 immunoadsorbed 있습니다. Hsp90 및 기타 보호자 역할 단백질 • hsp90 heterocomplex가 GR 공동 immunoadsorbed있는 내생 GR에 존재하고, GR은 스테로이드에 바인딩할 수 있습니다. Hsp90은 (STR) 소금 스트리핑이라고 약한 소금 치료를 사용하여 GR에서 dissociated 있습니다. 소금 막았죠 GR의 분열 스테로이드 바인딩은 스테로이드에 바인딩하는 것이없는 만들고, 닫힙니다. 중급 GR 바인딩 스테로이드 할 수있다 • hsp90 hsp70 포함 heterocomplexes, hsp40, 그리고 타가, 단백질 또는 reticulocyte lysate (Retic lysate) 및 cofactors를 정화와 소금 막았죠 GR을 잠복기로 (정찰기) 재구성 수 있습니다. 각 단계의 스테로이드 결합 활동과 immunopellet 단백질 내용은 하룻밤 사이에 [3 H] 스테로이드 인큐베이션 및 서양 각각 blotting에 의해 확인할 수 있습니다.
그림 3. immunoadsorbed 단지의 전기 단백질 분석. A, 재구성 GR의 SDS - PAGE electrotransfer 및 Coomassie의 얼룩 다음 기존 전기 시스템을 사용하여 몇 군데 • hsp90 heterocomplex. GR, hsp90과 hsp70뿐만 아니라, 중쇄 (HC) 및 항체의 경쇄 (LC)은 시각입니다. 분자량 마커 (kDa로 표현)의 마이 그 레이션은 왼쪽에 표시됩니다. B, 소금 막았죠 GR (STR) 및 재구성 GR • hsp90 heterocomplex (정찰기)를 포함하는 immunopellets 서양 얼룩. C, 재구성 GR의 가상 젤 Experion microfluidic 전기 영동 시스템을 사용하여 생성된 • hsp90 heterocomplex. (NI IgG) nonimmune 및 항체를 immunoadsorbing (안티 GR) 면역의 두 가지 다른 농도가 포함되어 있습니다. NI의 IgGs는 부정적인 컨트롤로 제공합니다. D, 재구성 GR의 electropherogram는 microfluidic 전기 패널 B. 장점 작은 샘플 볼륨에 대한 요구 사항을 포함의 세 번째 차선에 표시된 Experion microfluidic 전기 영동 샘플에서 얻은 • hsp90 heterocomplex은 개선 부량, 액체 처리 및 사후 실행 정리를 감소하고, 실질적으로 짧은 예제 실행됩니다.
그림 4. 내생 GR의 immunoadsorption (Enodg), 소금 막았죠 GR을 (STR) 다음 immunopellets의 스테로이드 결합 활동 및 GR을 재구성 • hsp90 heterocomplex (정찰기). 단클론 항 - GR immunoadsorbing 항체 (I)로 GR을 immunoadsorbing 이외에도, 각각의 조건에 대해 부정적인 컨트롤 샘플 nonimmune 면역 글로불린 (NI)를 사용하여 준비되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
위에서 설명한 분석은 hsp90/hsp70-based 보호자 기계의 보호자 역할 행동뿐만 아니라, GR 스테로이드 바인딩에 영향을 미치는 조건의 수많은 테스트를 적용할 수 있습니다. 그것은 이전에 보고된 방법 4,8,9,17의 수정이며 전기 영동 기술의 최근 발전을 활용하고 광범위한 연구 커뮤니티에 액세스할 수 있도록 설계되었습니다. 관심의 추가 cofactors이나 단백질은 GR에 추가할 수 있습니다 스테로이드 구속력 heterocomplex 단백질 단백질 상호 작용, 그리고 공동 요소 요구 사항에 대한 효과를 관찰하기 위해 프로토콜의 4 단계에서 설명한 • hsp90 heterocomplex의 reconstitution 혼합물,. 예를 들어, hsp90 기능에 국소 빈혈 reperfusion -의 영향은 반응 산소 종의 증가 농도의 추가와 모델 수 있습니다. 특정 기능 (예 : acetylated hsp90) 또는 잠재 hsp90 억제제 (예 : 소설 geldanamycin의 analogs)와 정화 단백질이 결정 스테로이드 구속력과 heterocomplex 형성 그들의 효과를 위해서 추가할 수 있습니다.
전기와는 다른 다운 스트림 assays는 blotting 양식, 스테로이드 바인딩 assays도 고용 수 있습니다. 예를 들어, immunoprecipitated multiprotein의 단지는 상당한 성공을 18,19로 유동세포계측법으로 분석되었습니다. immunoadsorbed GR은 • hsp90 단지도 hsp90/hsp70 염기 상태 assayed 또는 원자 힘 현미경을 사용하여 17 시각있을 수 있습니다. GR 이외의 Hsp90 클라이언트 단백질은 (chaperoning 검사점 키나제 I (Chk1) 20 예) 사용할 수 있으며, 정액 연구는 에스 트로겐 수용체, progesterone 수용체와 SRC 1,13,21이 프로토콜의 변형을 사용하여 수행되었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
전기 영동의 시약을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어는 바이오 방사선에 의해 제공되었다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 부여 GM086822 호프, 심장 연구소 기초 과학 수상하고, MJ 머독 자선 신탁 대학 과학 연구 프로그램의 국립 연구소에 의해 투자되었다. 전기 영동의 시약을 선택하고 이미지 분석 소프트웨어는 넉넉한 바이오 방사선에 의해 제공되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sf9 insect cells | Invitrogen | for baculovirus expression of recombinant mouse GR | |
| L929 cells | ATCC | CRL-2173 | for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression) |
| FiGR hybridoma cells | ATCC | CRL-2173 | for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody) |
| Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free | Roche Group | 11836170001 | |
| protein A-Sepharose | Sigma-Aldrich | P3391 | |
| rabbit reticulocyte lysate | Green Hectares (Oregon, WI) | rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery | |
| creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | for ATP-regenerating system |
| phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | for ATP-regenerating system |
| anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) | Pierce, Thermo Scientific | MA1-510 | used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-830 | used as primary antibody in western blotting |
| anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-820 | used as primary antibody in western blotting |
| IgG from mouse serum | Sigma-Aldrich | 038K7690 | used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption |
| anti-mouse IgG-peroxidase conjugate | Sigma-Aldrich | A4416 | used as secondary antibody in western blotting |
| Experion microfluidic electrophoresis system | Bio-Rad | 7007001 | alternative to conventional SDS-PAGE |
| [1,2,4,6,7-3H] dexamethasone | PerkinElmer, Inc. | NET1192001MC | follow safety precautions |
References
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery. Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).
- Murphy, P. J. M. Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention. Leukemia. 19, 710-712 (2005).
- Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).
- Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).
- Morishima, Y. The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system. J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).
- Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate. J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).
- Dittmar, K. D., Pratt, W. B. Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation. J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).
- Kanelakis, K. C. Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery. J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).
- Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes. Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).
- Murphy, P. J. M. Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation. J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket. J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).
- Pratt, W. B., Toft, D. O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones. Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).
- Bodwell, J. E. Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor. J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).
- Penna, A., Cahalan, M. W. estern Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).
- Choo, Y. S., Zhang, Z. Detection of Protein Ubiquitination. J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).
- Murphy, P. J. M. Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor•Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft. J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).
- Schrum, A. G. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).
- Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR). Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).
- Cintron, N. S., Toft, D. Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway. J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).
