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Biology

La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando

doi: 10.3791/3059 Published: September 21, 2011

Summary

Un

Abstract

Hsp90 es una proteína chaperona molecular esencial y muy abundante que se ha encontrado para regular más de 150 proteínas eucariotas de señalización, incluyendo los factores de transcripción (por ejemplo, los receptores nucleares, p53) y las proteínas quinasas (por ejemplo, Src, Raf, Akt cinasa) que participan en el ciclo celular, tumorigénesis, la apoptosis, y múltiples vías de señalización 1,2 eucariotas. Muchos de estos "clientes" de las proteínas hsp90, el montaje de receptores de esteroides • hsp90 complejos es el mejor definidos (Figura 1). Presentamos aquí un receptor adaptable glucocorticoides (GR) ensayo de inmunoprecipitación e in vitro GR • hsp90 método de reconstitución que puede ser fácilmente utilizada para explorar eucariotas hsp90 actividad funcional, hsp90 mediada por ligando de unión al receptor de esteroides, y los requisitos de cofactor molecular acompañante. Por ejemplo, este ensayo puede ser utilizado para probar los requisitos de hsp90 cofactor y los efectos de la adición de compuestos exógenos al proceso de reconstitución.

El GR ha sido un sistema muy útil para el estudio de hsp90 porque el receptor debe estar enlazado a hsp90 para tener una unión del ligando libre hendidura que sea accesible a los esteroides 3. GR endógeno, unliganded está presente en el citoplasma de las células de los mamíferos no covalentemente unido a hsp90. Como se encuentra en la GR • hsp90 endógeno heterocomplex, la unión del ligando GR hendidura abierta y capaz de unirse con esteroides. Si hsp90 se disocia de los recursos genéticos o si su función se inhibe, el receptor es incapaz de unirse con esteroides y requiere la reconstitución de la GR • hsp90 heterocomplex antes de la actividad de unión de esteroides se restaura 4. GR se puede immunoprecipitated de citosol de la célula utilizando un anticuerpo monoclonal, y las proteínas, tales como hsp90 complejos con el GR se puede analizar por Western blot. Actividad de unión de los esteroides GR immunoprecipitated se puede determinar mediante la incubación de la immunopellet con [3H] esteroides.

Los experimentos anteriores han demostrado hsp90 mediada por la apertura de la unión del ligando GR hendido requiere Hsp70, una chaperona molecular segundo también es esencial para la viabilidad de las células eucariotas. Actividad bioquímica de HSP90 y HSP70 son catalizadas por la co-Hop acompañante proteínas HSP40, y 5 de p23. Una maquinaria acompañante multiproteico que contiene HSP90, HSP70 Hop, y HSP40 son endógena presente en el citoplasma de la célula eucariota, y lisado de reticulocitos proporciona una acompañante-rica fuente de proteínas 6.

En el método presentado, GR es immunoadsorbed de citosol de la célula y despojado de la maquinaria acompañante endógeno hsp90/hsp70 con condiciones suaves de sal. El GR-sal despojado se incuba con lisado de reticulocitos, ATP, y K +, lo que resulta en la reconstitución de la GR • hsp90 heterocomplex y la reactivación de la actividad de unión de esteroides 7. Este método puede ser utilizado para probar los efectos de varios cofactores acompañante, nuevas proteínas, y los inhibidores de HSP90 experimental o GR con el fin de determinar su significado funcional de hsp90 mediada por esteroides vinculante 11.08.

Protocol

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1. Preparación de citosol de la célula que contiene GR funcional

  1. Nota técnica: Todos los tampones se deben refrigerar y cada paso de este protocolo, incluyendo centrifugaciones y la incubación, se debe realizar en hielo oa 4 ° C, a menos que se indique lo contrario. La baja temperatura es esencial para prevenir la degradación de los complejos de GR y proteínas.
  2. Utilizando una centrífuga refrigerada, obtener un ~ 1.5 ml de precipitado de células que expresa una alta concentración de GR funcional. Ejemplos de fuentes de células ricas en recursos genéticos incluyen fibroblastos de ratón L929, las cuales expresan una alta concentración de GR endógeno, y Sf9 células que han sido infectadas con el baculovirus recombinante GR (por ejemplo, el baculovirus p2Bac-MGR 12). Aproximadamente 15-20 ml de concentrado de hematíes se obtiene por litro de cultivo de células Sf9 baculovirus. Las células deben crecer de forma exponencial antes de la cosecha. Se centrifuga la suspensión celular a 5000 × g por 5 min.
  3. Lavar el pellet de células tres veces con 15 ml de solución salina tamponada de Hanks. Entre los mismos, con suavidad resuspender el precipitado, seguido por centrifugación a 5000 × g por 5 min. Tras el último lavado, eliminar completamente el sobrenadante.
  4. Prepare 7,5 ml de un tampón de homogeneización que contiene tampón HEM (HEPES 10 mM, 1 mM EDTA, 20 mM de molibdato de sodio, pH 7,4), 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), y 3 pastillas de baja del inhibidor de la proteasa completa-Mini. El PMSF y tabletas completas-Mini prevenir la proteólisis que se produzcan durante las etapas posteriores. Completa Mini-tabletas pueden ser fácilmente obtener un polvo fino con un mortero. Añadir 1,5 volúmenes de tampón de homogeneización a la bolita de células.
  5. La ruptura de las células de la homogeneización Dounce (50 golpes) o de congelación / descongelación (3 ciclos) técnica. Homogeneización Dounce puede mantener mejor endógeno GR • hsp90 complejos de proteínas y es más rápido para completar. Congelación / descongelación proporciona investigador la oportunidad de suspender el protocolo en este paso y continuar en otro momento. Homogeneización Dounce se debe realizar con el homogeneizador en un cubo de hielo para evitar la degradación de proteínas. Congelación / descongelación se puede realizar mediante la congelación del tubo de centrífuga que contiene el precipitado de células-homogeneización mezcla tampón con el nitrógeno líquido, hielo seco, o -20 ° C de incubación, seguido de un descongelamiento en un baño de agua a 30 ° C.
  6. Separar el citosol GR-que contiene células de la materia de partículas rotas por ultracentrifugación. Transferir el homogeneizado a los tubos de ultracentrífuga duraderos, las trompas de balance de masa de dos en dos, y se centrifuga a 100.000 g durante 30 minutos.
  7. Quitar el citosol (sobrenadante) y se almacena a -20 ° C en 500 alícuotas en tubos de 1,5 ml microcentrífuga para almacenamiento a largo plazo. Para mantener la máxima actividad GR funcional, flash-congelar las alícuotas en nitrógeno líquido o se incuba durante 30 segundos en una mezcla de metanol-baño de hielo seco antes de guardarlo. Tome la precaución de evitar el contacto directo con el reactivo de enfriamiento.

2. Inmunoadsorción de GR a partir de células citosol

  1. Nota técnica: La figura 2 proporciona una visión esquemática de los pasos 2-5 de este protocolo.
  2. Prepare una mezcla de inmunoadsorción que contienen inmunoglobulina monoclonal G (IgG) anticuerpo contra la GR a immunoadsorb el receptor preparado en el paso 1. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, combinar 100 l de descongelado GR-contiene citosol, 200 buffer TEGM l (8 TES mM, 4 mM EDTA, 50 mM NaCl, 20 mM de molibdato, el 10% (v / v) de glicerol, pH 7,6) , 100 l de un 20% de proteína A-Sepharosa (PAS) mg suspensión (v / v, preparada en tampón TEGM), y 5 de la anti-GR anticuerpo monoclonal IgG (por ejemplo, BuGR2). Molibdato está incluido en el buffer TEGM con el fin de ayudar a estabilizar el GR-hsp90 heterocomplex, que puede ser útil para endógeno ensayo heterocomplex esteroides actividad de unión 13.
    1. Anti-GR anticuerpo está disponible comercialmente como proteína purificada. Alternativamente, se puede obtener mediante la adición de 10 l de IgG anti-GR-ascitis que contiene a la mezcla de inmunoadsorción. La ascitis es producida por los ratones inyectados con anti-GR células de hibridoma (por ejemplo, células de hibridoma FiGR 14), y la concentración de anticuerpos aproximada obtenida a partir de la ascitis y utilizada en estos experimentos fue de 0,5 mg / l, medido por el ensayo de Bradford.
    2. Preparar una muestra de control negativo con GR-contiene citosol, buffer TEGM y PAS (como se describió anteriormente), y 5 mg de IgG que no reconoce el GR, hsp90 y otras proteínas chaperonas moleculares (conocida como "inmunes" de anticuerpos).
    3. Debido a la relativamente gran tamaño de grano de PAS, el uso de un corte P-200 punta de la pipeta para transferir PAS de la suspensión del 20% de los tubos de muestra. Consejos Corte pipeta se preparan cortando 2-3 mm del extremo de la disponible en el mercado 200 P-puntas, aumentando así la apertura de punta de la pipeta.
  3. Coloque las muestras en una rueda vertical de rotación y se incuba durante un mínimo de 2 horas con una rotación constante. Las muestras se puedense incubó durante hasta 8 horas sin pérdida de actividad.
  4. Al término de la incubación de inmunoadsorción, eliminar las proteínas no consolidados de la pastilla de anticuerpos-PAS ("immunopellet") por centrifugación. Separar el sobrenadante de immunopellets por centrifugación usando una centrífuga refrigerada programadas durante 1 minuto a 10.000 x g, y lavar dos veces con un tampón TEGM ml y mezclar. Después de la centrifugación y entre los mismos, descartar el sobrenadante teniendo cuidado de no alterar el pellet.
    1. Eliminar todos los sobrenadante al final de el segundo lavado. A fin de garantizar que ninguno de los pellets es darse cuenta de aspiración, utilice un ondulado P-200 punta de la pipeta de aspiración sobrenadante final. Puntas rizadas pipeta son preparados por aplastamiento disponibles en el mercado P-200 puntas con unas pinzas.

3. La disociación de hsp90 endógeno de GR immunopellet ("Salt stripping")

  1. Para el lavado immunopellet preparado en el paso 2, añadir 355 l tampón TEG (buffer TEGM sin molibdato de sodio) y 45 l de NaCl 5 M (concentración final de NaCl = 0,5 M).
  2. Coloque las muestras en una rueda vertical de rotación y se incuba durante 1,5 horas con una rotación constante. Las muestras pueden ser incubados durante un máximo de dos horas, sin embargo, ya incubaciones puede conducir a la recuperación de disminución de la proteína y la menor actividad funcional.
  3. Eliminar las proteínas no consolidados de la immunopellet por centrifugación. Girar las muestras durante 1 minuto a 10.000 x g. Lavar una vez con 1 ml de tampón TEG y una vez con 1 ml de tampón HEPES 10 mM, pH 7,4.
  4. Eliminar todos los sobrenadante al final de el segundo lavado, teniendo cuidado de no molestar a los immunopellet, con un P-200 prensado punta de la pipeta.

4. La reconstitución de la GR • hsp90 heterocomplex con chaperones moleculares, cofactores, y el ATP

  1. Nota técnica: Un gran número de condiciones experimentales se puede probar mediante la inclusión de proteínas adicionales, cofactores, activadores o inhibidores de interés en la mezcla de la reconstitución preparado a continuación. Volumen total de las mezclas de la reconstitución debe ser <120 microlitros.
  2. Para cada sal despojado immunopellet preparado en el paso 3, agregar la mezcla de la reconstitución con 50 l de una fuente de chaperona molecular y 5 l de un sistema de generación de ATP (10 mM HEPES, 50 mM ATP, 250 mM de fosfato de creatina, 20 mM de acetato de magnesio , 100 U / ml creatinfosfocinasa, pH 7,4).
    1. Las reacciones de la reconstitución se puede aumentar por complementar la mezcla de la reconstitución con 50 l de amortiguación HKD (HEPES 10 mM, 100 mM KCl, 5 mM ditiotreitol (DTT), pH 7,4) y un adicional de 5 l de sistema de generación de ATP. Este paso puede omitirse si la reconstitución amplia y vinculante de esteroides se observan. KCl aumenta la actividad de la ATPasa Hsp70 y TDT protege cisteína que contienen las proteínas de la oxidación 9.
    2. Una fuente recomendada chaperona molecular es lisado de reticulocitos de conejo disponibles en el mercado. Individuales chaperonas moleculares purificada a partir de lisado de reticulocitos o expresado recombinante (por ejemplo, 15 mg hsp90, hsp70 de 15 mg, 0,6 mg Hop, 6 mg p23, y 0.125 mg HSP40 en HKD buffer) también puede ser utilizado.
  3. Incubar las muestras en un baño de agua a 30 ° C durante exactamente 20 minutos. Tubos de película cada 1-2 minutos con el fin de perturbar el sedimento suave y mezclar la solución de reconstitución.
  4. Añadir 1 ml TEGM buffer, vortex y centrifugar a 10.000 xg durante 1 minuto. Retire y deseche el sobrenadante con cuidado de no perturbar el sedimento. Repita para un total de tres lavados. Eliminar por completo todas las sobrenadante al final de el lavado final con un ondulado P-200 punta de la pipeta.

5. Análisis de los complejos de proteínas reconstituida y la actividad de unión al ligando

  1. Las proteínas en la reconstitución immunopellet pueden ser identificados por electroforesis convencional en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE), electroforesis de microfluidos (por ejemplo, Bio-Rad Experion), y el Western Blot (Fig. 3). Nota técnica: Excelente descripción de los protocolos de SDS-PAGE 15 y el Western Blot 16 están actualmente disponibles, cortesía de otros investigadores.
    1. Añadir 50 l de tampón de muestra SDS-PAGE que contiene β-mercaptoetanol y agitar. Recetas específicas tampón de la muestra varían. Seleccione una base en la recomendación del fabricante del sistema de electroforesis que se emplearán.
    2. Incubar durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo o 100 º C de calor bloque electrónico.
    3. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 minuto. El anticuerpo immunoadsorbing, los recursos genéticos, y las proteínas formando complejos con GR se puede disociar el uno del otro y son liberados en el sobrenadante de la muestra de amortiguación.
    4. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco usando una punta ondulado P-200 pipeta de punta. Deseche el sedimento. La muestra está preparada para el análisis utilizando comercialmente disponibles SDS-PAGE o electroforesis de los sistemas de microfluidos. Completa el f técnicaespués de las instrucciones del fabricante.
    5. Western blot siguientes SDS-PAGE permite la identificación definitiva de los GR immunoadsorbed y chaperones moleculares complejos con el GR después de la incubación de la reconstitución. Use anticuerpos monoclonales básicos planteado contra GR (BuGR2), hsp90 (AC88), Hsp70 (N27F3-4) y proteínas chaperonas cooperación para detectar los principales componentes de la GR • hsp90 complejo de proteínas.
  2. Activación funcional de la GR-sal despojado tras la reconstitución de la GR • hsp90 puede ser complejo de proteínas identificadas mediante el análisis de actividad de unión de esteroides a [3H]-esteroides (Fig. 4). Para el resto del protocolo, siga las precauciones necesarias para manejar con seguridad las muestras de tritio y de los residuos.
    1. A la immunopellet reconstituido, añadir 47,5 buffer HEM l y 2,5 l de 2 M de [3H] dexametasona (concentración de esteroides final = 100 nm).
    2. Mezclar suavemente el pellet con cuidado para reducir al mínimo la cantidad de muestra de los desplazados a la pared del tubo de microcentrífuga.
    3. Incubar toda la noche en el hielo. No es necesario rotar o mezclar los tubos de muestra durante la incubación.
    4. Añadir un buffer TEGM ml, mezclar suavemente y centrifugar a 10.000 xg durante 1 minuto. Descartar el sobrenadante, teniendo presente que contiene no consolidados de [3H] esteroides. Repita para un total de 3 lavados con tampón TEGM.
    5. Eliminar por completo todas las sobrenadante al final de el lavado final con un ondulado P-200 punta de la pipeta. La pastilla contiene recursos genéticos, los chaperones moleculares hsp90 y otros complejos con los recursos genéticos, y el [3H] esteroides une específicamente al receptor. La unión no específica se puede calcular mediante la inclusión de 1.000 veces el exceso no tritiada dexametasona en la mezcla de incubación durante la noche. Como un control negativo alternativo, el anti-GR anticuerpos immunoadsorbing agregado en el paso 2.2 puede ser reemplazado por un no-GR-immunoadsorbing anticuerpos (NI).
    6. Suspender la immunopellets lavados en buffer de 200 l TEGM y la transferencia de viales de 10 ml de centelleo con un corte P-200 punta de la pipeta.
    7. Añadir 4,8 ml de cóctel de centelleo de los viales y Vortex.
    8. La cantidad de [3H] que vincula a los esteroides GR reconstituido • hsp90 complejo de proteínas puede ser analizado mediante espectrometría de centelleo líquido.

6. Los resultados representativos:

Representante SDS-PAGE y western blot datos se presentan en la Figura 3. El GR • hsp90 endógeno heterocomplex es immunoadsorbed de citosol de la célula utilizando anti-GR de anticuerpos y las proteínas individuales que co-immunoadsorb con el GR se visualizaron por tinción con Coomassie (Fig. 3). La confirmación de la identidad de las proteínas de cualquier componente de la immunopellet en cualquier etapa de la prueba de la reconstitución se puede hacer mediante el cálculo de SDS-PAGE de peso molecular y el Western Blot utilizando anticuerpos monoclonales contra la proteína de interés.

GR reconstituido • hsp90 heterocomplejos se presentan mediante Experion datos de electroforesis de microfluidos (Fig. 3C y 3D) y análisis por Western blot (Fig. 3B). La especificidad de la inmunoadsorción GR se confirma mediante la sustitución de la immunoadsorbing anti-GR anticuerpo con un anticuerpo no inmune (Fig. 3C, NI carriles IgG). Incluso cuando una excesiva cantidad de anticuerpos no inmunes se utilizan, no chaperones moleculares o GR son immunoprecipitated (cf. en la figura. 3C, los recursos genéticos, hsp90 y hsp70 de las bandas de proteínas presentes en los carriles de contra-GR inmunoadsorción con la falta de banda observada en el NI IgG carriles). Asimismo, es posible confirmar la disociación de hsp90 y otras proteínas chaperonas de la GR-sal despojado por Western blot (Fig. 3B) de la immunopellets desnudaron y reconstituido. La cadena pesada del anticuerpo immunoadsorbing (HC) es detectable por tanto tinción de Coomassie y Western Blot, y que sirve para confirmar la igualdad de immunopellets tamaño se aprecian en cada carril.

Actividad de unión de los esteroides GR immunoadsorbed se puede probar por todos las condiciones ensayadas, y representante de enlace de datos de esteroides se presentan en la Figura 4. GR • hsp90 endógeno heterocomplejos se immunoadsorbed, sal-despojado, y reconstituido. Utilizando cualquiera de lisado de reticulocitos o proteínas purificadas, la actividad de esteroides vinculante de la GR reconstituido • hsp90 heterocomplex normalmente regresa a un 75-100% de los recursos genéticos endógenos • hsp90 nivel de actividad de unión. Similar a los datos de la electroforesis, un anticuerpo no inmunes (NI) se puede utilizar en lugar del anticuerpo anti-GR (I) con el fin de servir como un control negativo y como una medida de no específicos [3 H] que vincula esteroides.

Figura 1
Figura 1. Modelo de Asamblea heterocomplex GR • hsp90 y GR esteroides apertura de fisura vinculante. La maquinaria acompañante hsp90/hsp70-based convierte el dominio ligando GR vinculante de un folconformación del DED en el que la unión de esteroides fisura se cierra y no se puede acceder a la hormona de una conformación abierta hendidura que se puede acceder (ilustrado por el icono heterocíclicos con esteroides). La maquinaria acompañante es premontado en la célula y de forma espontánea se forma una vez purificados, hsp90, hsp70, y Hop se mezclan en solución (Reacción 1). Hop contiene 34 aminoácidos repetir tetratricopeptide ácido (TPR) de dominio (que se ilustra como una media luna oscura), y más tarde reemplazado durante el proceso de maduración heterocomplex por un dominio que contienen proteínas TPR inmunofilina. La maquinaria se abre la unión de esteroides hendidura en un ATP-y K +-dependiente, tras lo cual Hop y en última instancia, la mayoría de las Hsp70 y HSP40 salir del complejo (se muestra como un icono de puntos). Mecánica, Hsp70 interactúa con el GR antes de hsp90 y prepara el receptor de la hsp90 y la apertura de fisura posterior. Experimentalmente, la unión de esteroides y la apertura de GR hendido se incrementan si HSP90 y HSP70 están presentes simultáneamente. El heterocomplex se estabiliza por la entrada de la co-chaperona hsp90 p23, que mantiene hsp90 en una conformación ATP de ruedas. Después de la salida de Hop, un alto peso molecular inmunofilina (IMM) se puede unir hsp90, que forman el heterocomplex final, ya que se recupera de las células. Adaptado de Pratt y Toft 1.

Figura 2
Figura 2. Representación esquemática de los pasos 2-5 de este protocolo. El GR es immunoadsorbed de citosol de la célula utilizando un anticuerpo monoclonal contra el GR (FiGR), vinculado a una bolita de la proteína A-Sepharosa. Hsp90 y otras proteínas chaperonas presentes en el GR endógenas • hsp90 heterocomplex co-immunoadsorbed con la GR, y GR es capaz de unirse a los esteroides. Hsp90 es indisociable de GR con un tratamiento de sal suave, conocido como sal-stripping (Fue). La unión de esteroides hendidura de la sal-despojado GR se cierra, por lo que es incapaz de unirse a los esteroides. Intermedio GR • hsp90 heterocomplejos contiene hsp70, HSP40, y Hop, que son capaces de unirse con esteroides, puede ser reconstituido (Recon) mediante la incubación de la sal-despojado GR con proteínas purificadas o lisado de reticulocitos (reticulocitos lisado) y cofactores. La actividad de unión de esteroides y el contenido de proteína immunopellet de cada paso se pueden identificar por la noche [3H]-incubación de esteroides y el Western Blot, respectivamente.

Figura 3
Figura 3. Análisis de proteínas de los complejos immunoadsorbed electroforética. A, SDS-PAGE de GR reconstituido • hsp90 heterocomplex imágenes utilizando el sistema de electroforesis convencional seguida de electrotransferencia y la tinción de Coomassie. Además de los recursos genéticos, hsp90 y hsp70, la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de los anticuerpos se visualizan. La migración de los marcadores de peso molecular (expresado en kDa) se indican en la izquierda. B, de Western blot de immunopellets contiene sal despojado GR (Fue) y GR • hsp90 heterocomplex reconstituido (Recon). C, gel virtual de GR reconstituido • hsp90 heterocomplex generado mediante un sistema de microfluidos Experion electroforesis. Dos concentraciones diferentes de un no inmunes (NI IgG) e inmune (anti-GR) immunoadsorbing anticuerpos están incluidos. IgGs NI sirven como controles negativos. D, electroferograma de GR reconstituido • hsp90 heterocomplex obtenidas de una muestra de microfluidos Experion electroforesis se muestra en el tercer carril del panel B. Ventajas de la electroforesis de microfluidos incluye el requisito de volumen de las muestras más pequeñas, la disminución de manejo de líquidos y la limpieza posterior a la ejecución, la cuantificación de la mejora, y mucho más corto de ejemplo se ejecuta.

Figura 4
Figura 4. La actividad de unión de los esteroides immunopellets siguientes inmunoadsorción de GR endógena (Enodg), sal-despojado GR (Fue), y se reconstituye GR • hsp90 heterocomplex (Recon). Además de la GR immunoadsorbing con un anticuerpo monoclonal anti-GR anticuerpos immunoadsorbing (I), las muestras de control negativo para cada condición se prepararon utilizando una inmunoglobulina no inmunes (NI).

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Discussion

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El ensayo descrito anteriormente se puede adaptar para poner a prueba un gran número de condiciones que afectan a las acciones acompañante de la maquinaria acompañante hsp90/hsp70-based así como enlazar GR esteroides. Se trata de una modificación de los métodos previamente reportados 4,8,9,17 y está diseñado para aprovechar los avances recientes en tecnología de electroforesis y ser accesible a una comunidad de investigación más amplio. Cofactores adicionales o proteínas de interés se pueden añadir a la GR • hsp90 mezcla de reconstitución heterocomplex, que se describe en el Paso 4 del Protocolo, con el fin de observar los efectos de los esteroides vinculante, heterocomplex interacciones proteína-proteína, y los requisitos de co-factor. Por ejemplo, los efectos de la isquemia-reperfusión en la función Hsp90 puede ser modelado con la adición de concentraciones crecientes de especies reactivas del oxígeno. Proteínas purificadas con una característica específica (por ejemplo, acetilado hsp90) o potencial de los inhibidores de HSP90 (por ejemplo, análogos de geldanamicina novela) se pueden agregar para que sus efectos sobre la formación de esteroides vinculante y heterocomplex por determinar.

Aguas abajo, diferentes ensayos de electroforesis, ensayos de unión de Western Blot, y los esteroides también puede ser empleado. Por ejemplo, los complejos immunoprecipitated multiproteico han sido analizadas por citometría de flujo con un éxito considerable 18,19. El GR immunoadsorbed • hsp90 complejos también se pueden ensayar para el estado de nucleótidos hsp90/hsp70 o visualizado mediante microscopía de fuerza atómica 17. Hsp90 proteínas cliente que no sea el GR se puede utilizar (por ejemplo, acompañante en puesto de control quinasa I (Chk1) 20), y la investigación seminal se ha realizado utilizando las variaciones de este protocolo con el receptor de estrógeno, receptor de progesterona, y Src 1,13,21.

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Disclosures

Seleccionar los reactivos de electroforesis y el software de análisis de imágenes fueron proporcionadas por Bio-Rad.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM086822, Hope Heart Institute premio de Ciencias Básicas, y el MJ Murdock Charitable Trust Programa Facultad de Ciencias de la Investigación. Seleccionar los reactivos de electroforesis y el software de análisis de imágenes fueron generosamente proporcionadas por Bio-Rad.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sf9 insect cells Invitrogen for baculovirus expression of recombinant mouse GR
L929 cells ATCC CRL-2173 for endogenous mouse GR cytosol preparation (alternative to baculovirus expression)
FiGR hybridoma cells ATCC CRL-2173 for preparing ascites containing anti-GR monoclonal antibody (alternative to purified BuGR2 antibody)
Complete-Mini protease inhibitor, EDTA-free Roche Group 11836170001
protein A-Sepharose Sigma-Aldrich P3391
rabbit reticulocyte lysate Green Hectares (Oregon, WI) rich source of endogenous hsp90/hsp70 chaperone machinery
creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C3755 for ATP-regenerating system
phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936 for ATP-regenerating system
anti-GR mouse monoclonal antibody (BuGR2) Pierce, Thermo Scientific MA1-510 used for GR immunoadsorption and as primary antibody in western blotting
anti-hsp90 mouse monoclonal antibody (AC88) Enzo Life Sciences ADI-SPA-830 used as primary antibody in western blotting
anti-hsp70 mouse monoclonal antibody (N27F3-4) Enzo Life Sciences ADI-SPA-820 used as primary antibody in western blotting
IgG from mouse serum Sigma-Aldrich 038K7690 used as nonimmune antibody for negative control of immunoadsorption
anti-mouse IgG-peroxidase conjugate Sigma-Aldrich A4416 used as secondary antibody in western blotting
Experion microfluidic electrophoresis system Bio-Rad 7007001 alternative to conventional SDS-PAGE
[1,2,4,6,7-3H] dexamethasone PerkinElmer, Inc. NET1192001MC follow safety precautions

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References

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La reconstitución bioquímicos de receptor de esteroides • Hsp90 complejos de proteínas y reactivación de la unión del ligando
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Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).More

Murphy, P. J. M., Franklin, H. R., Furukawa, N. W. Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor•Hsp90 Protein Complexes and Reactivation of Ligand Binding. J. Vis. Exp. (55), e3059, doi:10.3791/3059 (2011).

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