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Biology

准备在微流体装置E18条块皮质大鼠神经元

doi: 10.3791/305 Published: October 1, 2007

Summary

在这个视频中,我们展示了E18皮质大鼠神经元的准备。

Abstract

在这个视频中,我们展示了E18皮质大鼠神经元的准备。 E18皮质大鼠以前解剖,并准备从E18胎鼠大脑皮层神经元得到。 E18皮层,清扫后,立即到单个神经元的分离。它可以存储长达一个星期的E18皮质休眠发送含有B27的缓冲区4 ° C的分解是执行之前。然而,将细胞活力下降。通常情况下,我们获得我们的E18的Cortex新鲜。在冰冷的无钙镁免费清扫缓冲区(招商基金)被运送到实验室。抵达后,胰蛋白酶添加到皮质的终浓度为0.125%。皮层,然后在37℃孵育8分钟。 DMEM培养液含10%胎牛血清添加到皮质停止反应。然后在2分钟2500转离心皮质。上清被删除,含2%B27(体积/体积)和0.25%Glutamax(体积/体积),然后向上和向下吹打重悬的皮质神经基底媒体2毫升(NBM)。下一步,皮质是磨碎与以前火抛光的玻璃滴管,用较小的一个连续的开放每个。研制过程后,皮层再次离心2分钟2500转。然后取出上清液和皮质颗粒重新悬浮2毫升含有B27与Glutamax的NBM。细胞悬液,然后通过一个40微米的尼龙细胞过滤网。下一步的细胞计数。现正准备装载到神经元的微流体装置的神经元。

Protocol

准备E18胎鼠皮层神经元为条块

开始之前,重要的是温暖的一切必要的媒体和试剂,以37 ° C

同样重要的是消毒一切准备的细胞(例如,橡胶灯泡,试管架,媒体瓶,等),并用70%乙醇擦拭,这是摆在引擎盖。

  1. 放置在一个15毫升中含1毫升冰冷无钙镁免费清扫缓冲管两件E18胎鼠皮层(大脑,以前解剖)。
  2. 加入1毫升0.25%胰蛋白酶- EDTA的皮质夹层缓冲,使最终体积为2毫升和最终胰蛋白酶的浓度为0.125%。
  3. 在37℃水浴8分钟中放置15毫升管。
  4. 在此期间,消防波兰3玻璃巴斯德吸管,形成连续较小的开口,在生物安全柜,以帮助保持无菌。
  5. 皮层潜伏期8分钟后,添加10毫升的DMEM含10%胎牛血清的皮质,以帮助阻止胰蛋白酶反应。
  6. 离心15 mL的试管中,在2分钟2500转的皮质和DMEM/10%FBS。
  7. 在生物安全柜,取出上清液用巴斯德玻璃吸管连接真空吸皮质。要小心不要去打扰或撞出颗粒。
  8. 加入1毫升的NMB皮层颗粒,轻轻吸管向上和向下。这是非常重要,以避免产生气泡而pipeting向上和向下,气泡可损害细胞氧化。
  9. 使用最广泛的开放的火抛光的巴斯德吸管磨碎附加无菌的橡胶球,最终pipeting向上和向下的5倍皮层,再小心不要引入气泡。这个过程中继续与其他2个玻璃吸管,每一个开口尺寸减少。
  10. trituration后,再次离心下来的细胞在2分钟2500转。
  11. 离心后,再次去除上清,重悬细胞沉淀在2毫升的NBM。
  12. 通过一个45微米的细胞过滤器过滤悬浮细胞溶液。
  13. 用台盼蓝染色,计数,并加载到设备的细胞。我们通常装载20细胞每台设备的UL。

:终浓度的细胞通常是250万细胞/毫升和800万细胞/毫升之间

载入细胞

后的细胞已被计算,它是时间的负载设备的细胞:

  1. 把先前准备好的设备,将含有生物安全柜的NBM保持无菌。
  2. 从井中取出多余的介质,通过真空抽吸。但是,要小心,以避免删除所有的媒体 - 必须有一些媒体的主渠道。
  3. 20细胞UL应用设备的顶部左手水库(如有必要,见图表)。细胞进入设备的流量和连接到PLL的表面处理。
  4. 加载后,放置10分钟含细胞回的设备,让细胞附着在一个孵化器。
  5. 10分钟后,填补与媒体和地方的设备在孵化器的水库。

Discussion

根据不同的应用,可以是多种多样的细胞密度。然而,播种密度过低的主要神经元通常会导致细胞死亡。根据不同的孵化器和湿度水平,媒体可能需要在设备改为每2至3天。不断变化的媒体时,这是很重要的媒体取出后水库,切勿从媒体的主渠道。此外,新媒体,并放置在顶部的井,让一些新鲜的媒体流通过设备进入主渠道,填补了所有的水塘前,它是很好的做法。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NBM medium Invitrogen 21103-049 Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos Animal Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS buffer ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA Reagent Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets Fisher Scientific glass
DMEM medium Invitrogen
FBS Reagent Invitrogen serum, used at 10% in DMEM
centrifuge set at 2500 rpm
Trypan Blue Invitrogen for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um Tool BD Biosciences Falcon cat# 352340 Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.

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References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
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Cite this Article

Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).More

Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).

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