Summary
在这个视频中，我们展示了E18皮质大鼠神经元的准备。
Abstract
在这个视频中，我们展示了E18皮质大鼠神经元的准备。 E18皮质大鼠以前解剖，并准备从E18胎鼠大脑皮层神经元得到。 E18皮层，清扫后，立即到单个神经元的分离。它可以存储长达一个星期的E18皮质休眠发送含有B27的缓冲区4 ° C的分解是执行之前。然而，将细胞活力下降。通常情况下，我们获得我们的E18的Cortex新鲜。在冰冷的无钙镁免费清扫缓冲区（招商基金）被运送到实验室。抵达后，胰蛋白酶添加到皮质的终浓度为0.125％。皮层，然后在37℃孵育8分钟。 DMEM培养液含10％胎牛血清添加到皮质停止反应。然后在2分钟2500转离心皮质。上清被删除，含2％B27（体积/体积）和0.25％Glutamax（体积/体积），然后向上和向下吹打重悬的皮质神经基底媒体2毫升（NBM）。下一步，皮质是磨碎与以前火抛光的玻璃滴管，用较小的一个连续的开放每个。研制过程后，皮层再次离心2分钟2500转。然后取出上清液和皮质颗粒重新悬浮2毫升含有B27与Glutamax的NBM。细胞悬液，然后通过一个40微米的尼龙细胞过滤网。下一步的细胞计数。现正准备装载到神经元的微流体装置的神经元。
Protocol
准备E18胎鼠皮层神经元为条块
开始之前，重要的是温暖的一切必要的媒体和试剂，以37 ° C
同样重要的是消毒一切准备的细胞（例如，橡胶灯泡，试管架，媒体瓶，等），并用70％乙醇擦拭，这是摆在引擎盖。
- 放置在一个15毫升中含1毫升冰冷无钙镁免费清扫缓冲管两件E18胎鼠皮层（大脑，以前解剖）。
- 加入1毫升0.25％胰蛋白酶- EDTA的皮质夹层缓冲，使最终体积为2毫升和最终胰蛋白酶的浓度为0.125％。
- 在37℃水浴8分钟中放置15毫升管。
- 在此期间，消防波兰3玻璃巴斯德吸管，形成连续较小的开口，在生物安全柜，以帮助保持无菌。
- 皮层潜伏期8分钟后，添加10毫升的DMEM含10％胎牛血清的皮质，以帮助阻止胰蛋白酶反应。
- 离心15 mL的试管中，在2分钟2500转的皮质和DMEM/10％FBS。
- 在生物安全柜，取出上清液用巴斯德玻璃吸管连接真空吸皮质。要小心不要去打扰或撞出颗粒。
- 加入1毫升的NMB皮层颗粒，轻轻吸管向上和向下。这是非常重要，以避免产生气泡而pipeting向上和向下，气泡可损害细胞氧化。
- 使用最广泛的开放的火抛光的巴斯德吸管磨碎附加无菌的橡胶球，最终pipeting向上和向下的5倍皮层，再小心不要引入气泡。这个过程中继续与其他2个玻璃吸管，每一个开口尺寸减少。
- trituration后，再次离心下来的细胞在2分钟2500转。
- 离心后，再次去除上清，重悬细胞沉淀在2毫升的NBM。
- 通过一个45微米的细胞过滤器过滤悬浮细胞溶液。
- 用台盼蓝染色，计数，并加载到设备的细胞。我们通常装载20细胞每台设备的UL。
注 ：终浓度的细胞通常是250万细胞/毫升和800万细胞/毫升之间
载入细胞
后的细胞已被计算，它是时间的负载设备的细胞：
- 把先前准备好的设备，将含有生物安全柜的NBM保持无菌。
- 从井中取出多余的介质，通过真空抽吸。但是，要小心，以避免删除所有的媒体 - 必须有一些媒体的主渠道。
- 20细胞UL应用设备的顶部左手水库（如有必要，见图表）。细胞进入设备的流量和连接到PLL的表面处理。
- 加载后，放置10分钟含细胞回的设备，让细胞附着在一个孵化器。
- 10分钟后，填补与媒体和地方的设备在孵化器的水库。
Discussion
根据不同的应用，可以是多种多样的细胞密度。然而，播种密度过低的主要神经元通常会导致细胞死亡。根据不同的孵化器和湿度水平，媒体可能需要在设备改为每2至3天。不断变化的媒体时，这是很重要的媒体取出后水库，切勿从媒体的主渠道。此外，新媒体，并放置在顶部的井，让一些新鲜的媒体流通过设备进入主渠道，填补了所有的水塘前，它是很好的做法。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
