Summary
In deze video laten we zien de voorbereiding van de E18 Corticale Rat neuronen.
Abstract
In deze video, tonen we de voorbereiding van de E18 corticale rat neuronen. E18 corticale rat neuronen worden verkregen uit E18 foetale rat cortex eerder ontleed en voorbereid. De E18 cortex is, na ontleding, onmiddellijk gedissocieerd in individuele neuronen. Het is mogelijk om E18 cortex op te slaan in de sluimerstand E buffer met B27 bij 4 ° C gedurende maximaal een week voordat de dissociatie wordt uitgevoerd. Toch zal er een daling van de levensvatbaarheid van de cellen. Normaal gesproken krijgen we onze E18 Cortex fris. Het is vervoerd naar het lab in ijskoud Calcium Magnesium gratis gratis dissectie buffer (CMFM). Bij aankomst wordt trypsine toegevoegd aan de cortex tot een uiteindelijke concentratie van 0,125%. De cortex is vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 8 minuten. DMEM met 10% FBS wordt toegevoegd aan de cortex om de reactie te stoppen. De cortex wordt dan gecentrifugeerd bij 2500 rpm gedurende 2 minuten. Het supernatant wordt verwijderd en 2 ml van Neurale Basale Media (NBM) met 2% B27 (vol / vol) en 0,25% Glutamax (vol / vol) wordt toegevoegd aan de cortex, die vervolgens opnieuw wordt geschorst door en neer te pipetteren. Vervolgens wordt de cortex getritureerd met eerder vuur gepolijst glas pipetten, elk met een opeenvolgende kleinere opening. Na het fijnwrijven, is de cortex weer gecentrifugeerd bij 2500 rpm gedurende 2 minuten. Het supernatant wordt dan verwijderd en de cortex pellet geresuspendeerd met 2 ml van NBM met B27 en Glutamax. De celsuspensie wordt vervolgens door een 40 um nylon cel zeef. Vervolgens worden de cellen worden geteld. De neuronen zijn nu klaar voor het laden in het neuron microfluïdische apparaat.
Protocol
Voorbereiden E18 Foetale Rat corticale neuronen voor Compartimentering
Voordat u begint, is het belangrijk om alle nodige media en reagentia warm tot 37 ° C.
Het is ook belangrijk om te steriliseren alles dat wordt gebruikt voor het bereiden van de cellen (bijv. rubber bollen, reageerbuisrekken, media flessen, enz.), en dat die wordt geplaatst in de motorkap, door af te vegen af met 70% ethanol.
- Leg twee stukken van de E18 Foetale Rat Cortex (een brein, eerder ontleed) in een 15 ml buis met daarin 1 ml ijskoud Calcium-Magnesium free-free dissectie buffer.
- Voeg 1 ml van 0,25% trypsine-EDTA voor de cortex in dissectie buffer, waardoor het uiteindelijke volume van 2 ml trypsine en de uiteindelijke concentratie 0,125%.
- Plaats de 15 ml buis in een 37 ° C waterbad gedurende 8 minuten.
- Gedurende deze tijd, brand polish 3 glazen pipetten Pasteur, de vorming van achtereenvolgens kleinere openingen, in een kast bioveiligheid te helpen handhaven steriliteit.
- Na de 8 minuten incubatie van de cortex, voeg 10 ml DMEM met 10% FBS naar de cortex om de trypsine reactie te stoppen.
- Centrifugeer de 15 ml buis met de cortex en de DMEM/10% FBS bij 2500 rpm gedurende 2 minuten.
- In de bioveiligheid kabinet, verwijder het supernatans van de cortex met behulp van een glazen Pasteur pipet met vacuüm zuigen bevestigd. Wees voorzichtig niet te verstoren of los de pellet.
- Voeg 1 ml van NMB naar de cortex pellet en voorzichtig pipet op en neer. Het is heel belangrijk om te voorkomen dat het creëren van luchtbellen tijdens het pipetteren op en neer, omdat de luchtbellen kunnen de cellen beschadigen door oxidatie.
- Gebruik de brand-gepolijste Pasteur pipet met de breedste opening naar de cortex vermaal door het aanbrengen van een steriele rubber bol naar het einde en op en neer pipetteren 5 keer, opnieuw en let niet om luchtbellen te introduceren. Herhaal dit proces met de andere 2 glazen pipetten, elk met een verminderde opening grootte.
- Na tritureren, centrifuge beneden de cellen weer bij 2500 rpm gedurende 2 minuten.
- Na het centrifugeren, nogmaals de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de celpellet in 2 ml van de NBM.
- Filter de geresuspendeerde cel oplossing door een 45 um cel zeef.
- Vlekken op de cellen met trypaan blauw, geteld, en geladen in de apparaten. We meestal belasting 20 ul van cellen per apparaat.
Let op: de uiteindelijke concentratie van cellen is meestal tussen de 2,5 miljoen cellen / ml en 8 miljoen cellen / ml
Het laden van de cellen
Nadat de cellen zijn geteld, is het tijd om de cellen laden in het apparaat:
- Breng de vooraf bereide hulpmiddelen die NBM in de bioveiligheid kabinet om de steriliteit te behouden.
- Verwijder het overtollige papier uit de putten door afzuiging. Wees echter voorzichtig om te voorkomen dat het verwijderen van alle van de media - er moet worden sommige media in het hoofdkanaal.
- Van toepassing zijn 20 ul van cellen aan de linker reservoir van het apparaat (zie schema indien nodig). De cellen stroom in het apparaat en hechten aan de PLL behandelde oppervlak.
- Na het laden, plaatst u de apparaten bevattende cellen terug in een incubator gedurende 10 minuten om de cellen te hechten.
- Na 10 minuten, vul de reservoirs met media-apparaten en plaats terug in de incubator.
Discussion
Celdichtheden kan worden gevarieerd afhankelijk van de toepassing. Echter, zaaien primaire neuronen op een te lage dichtheid van een typisch leidt tot celdood. Afhankelijk van de incubator en het niveau van de luchtvochtigheid, kan media moeten worden gewijzigd in de apparaten om de 2 tot 3 dagen. Bij het wijzigen van media, is het belangrijk na het verwijderen van de media uit de reservoirs, om nooit materiaal uit de hoofdkanalen. Verder is het een goede gewoonte om nieuwe media plaats in de top putten en laat wat verse media door het apparaat en in de belangrijkste kanalen stroom voor het vullen van alle reservoirs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NBM | medium | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| E18 rat embryos | Animal | Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex. | ||
| CMFM dissection buffer HBSS | buffer | ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based. | ||
| 15 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | ||
| 37˚C water bath | ||||
| Pasteur pipets | Fisher Scientific | glass | ||
| DMEM | medium | Invitrogen | ||
| FBS | Reagent | Invitrogen | serum, used at 10% in DMEM | |
| centrifuge | set at 2500 rpm | |||
| Trypan Blue | Invitrogen | for counting live/dead cells | ||
| BD Falcon Cell Strainer 40 um | Tool | BD Biosciences | Falcon cat# 352340 | Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1 |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
