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Biology

Preparando E18 neurônios de rato para Cortical Compartimentação em um dispositivo micro

doi: 10.3791/305 Published: October 1, 2007

Summary

Neste vídeo mostramos a preparação de E18 neurônios de rato Cortical.

Abstract

Neste vídeo, demonstramos a preparação de E18 neurônios de rato cortical. E18 neurônios de rato cortical são obtidos a partir E18 córtex do rato fetal previamente dissecados e preparados. O córtex é E18, à dissecção, imediatamente dissociado em neurônios individuais. É possível armazenar E18 córtex em Hibernate tampão contendo B27 E a 4 ° C por até uma semana antes da dissociação é realizada. No entanto, haverá uma queda na viabilidade celular. Normalmente obtemos o nosso E18 Cortex fresco. Ele é transportado para o laboratório em gelo frio livre de buffer Cálcio Magnésio dissecção livre (CMFM). Após a chegada, a tripsina é adicionado ao córtex para uma concentração final de 0,125%. O córtex é, então, incubados a 37 ° C por 8 minutos. DMEM contendo 10% FBS é adicionado ao córtex para parar a reação. O córtex é então centrifugado a 2500 rpm por 2 minutos. O sobrenadante é removido e 2 ml de Neural Mídia Basal (NBM) que contenha 2% B27 (vol / vol) e 0,25% Glutamax (vol / vol) é adicionado para o córtex, que é então re-suspenso por pipetando para cima e para baixo. Em seguida, o córtex é triturado previamente fogo com pipetas de vidro polido, cada um com uma abertura sucessivas menores. Após trituração, o córtex é mais uma vez centrifugado a 2500 rpm por 2 minutos. O sobrenadante é então removido eo pellet córtex re-suspenso com 2 ml de NBM contendo B27 e Glutamax. A suspensão de células é então passado através de um filtro de células 40 hum nylon. Em seguida as células são contadas. Os neurônios estão agora prontos para carregar no dispositivo micro neurônio.

Protocol

Preparando E18 neurônios de rato Fetal Cortical para Compartimentação

Antes de começar, é importante para aquecer todos os meios necessários e reagentes para 37 ° C.

Também é importante para esterilizar tudo o que é usado para preparar as células (por exemplo, lâmpadas de borracha, suportes de tubos, frascos de mídia, etc), e aquilo que é colocado na capa, limpando-se com etanol 70%.

  1. Coloque dois pedaços de E18 Cortex Rato Fetal (um cérebro, previamente dissecado) em um tubo de 15 ml contendo 1 ml gelada de cálcio sem magnésio livre de buffer de dissecção.
  2. Adicionar 1 ml de 0,25% Tripsina-EDTA para o córtex em tampão dissecção, elevando o volume final de 2 ml de tripsina e concentração final de 0,125%.
  3. Colocar o tubo de 15 ml em um banho de água 37 ° C por 8 minutos.
  4. Durante este tempo, o fogo polonês 3 pipetas de vidro Pasteur, formando aberturas sucessivamente menores, em um armário de biossegurança para ajudar a manter a esterilidade.
  5. Após a incubação 8 minutos do córtex, adicione 10 ml de DMEM contendo 10% FBS para o córtex para ajudar a parar a reação de tripsina.
  6. Centrifugar o tubo contendo 15 ml do córtex e DMEM/10% FBS a 2500 rpm por 2 minutos.
  7. No armário de biossegurança, remover o sobrenadante do córtex usando um copo pipeta Pasteur com sucção a vácuo em anexo. Tenha cuidado para não perturbar ou deslocar o pellet.
  8. Adicionar 1 ml da NMB ao pellet córtex e gentilmente pipeta cima e para baixo. É muito importante para evitar a criação de bolhas de ar enquanto pipetagem cima e para baixo, como as bolhas de ar podem danificar as células por oxidação.
  9. Use o fogo-polido pipeta Pasteur com a mais ampla abertura para triturar o córtex, anexando um bulbo de borracha estéreis até o fim e pipetagem cima e para baixo 5 vezes, novamente tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Continue esse processo com as outras duas pipetas de vidro, cada uma com um tamanho de abertura diminuiu.
  10. Após a trituração, centrifugação as células novamente a 2500 rpm por 2 minutos.
  11. Após a centrifugação, uma vez remover o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 2 ml de NBM.
  12. Filtrar a solução de células ressuspenso através de um filtro de células 45 um.
  13. Mancha as células com Trypan Blue, contados, e carregado no dispositivos. Normalmente, carga de 20 ul de células por dispositivo.

Nota: a concentração final de células é tipicamente entre 2,5 milhões de células / ml e 8 milhões de células / ml

Carregando as células

Depois que as células foram contadas, é hora de carregar as pilhas no dispositivo:

  1. Traga os dispositivos previamente preparado contendo NBM para a cabine de segurança biológica para manter a esterilidade.
  2. Retire o excesso de mídia dos poços por sucção a vácuo. No entanto, ter cuidado para evitar a remoção de todos os meios de comunicação - deve haver alguns meios de comunicação no canal principal.
  3. Aplicar 20 ul de células para o reservatório superior esquerdo do dispositivo (veja o diagrama se necessário). O fluxo de células dentro do dispositivo e anexar à superfície PLL tratada.
  4. Depois de carregar, colocar os dispositivos contendo células de volta em uma incubadora por 10 minutos para permitir que as células para anexar.
  5. Após 10 minutos, preencher os reservatórios com a mídia e dispositivos lugar de volta na incubadora.

Discussion

Densidades de células pode ser variado, dependendo da aplicação. No entanto, a semeadura em neurônios primários muito baixa de uma densidade normalmente leva à morte celular. Dependendo da incubadora e do nível de umidade, a mídia pode ter de ser alterado nos dispositivos a cada 2 a 3 dias. Ao mudar de mídia, é importante após a remoção da mídia a partir dos reservatórios, para nunca remover a mídia dos canais principais. Além disso, é boa prática colocar novas mídias nos poços superior e permitir que alguns meios de comunicação fresca a fluir através do dispositivo e para os principais canais antes de encher todos os reservatórios.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NBM medium Invitrogen 21103-049 Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos Animal Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS buffer ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube Tool BD Biosciences Falcon No. 352097 Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA Reagent Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets Fisher Scientific glass
DMEM medium Invitrogen
FBS Reagent Invitrogen serum, used at 10% in DMEM
centrifuge set at 2500 rpm
Trypan Blue Invitrogen for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um Tool BD Biosciences Falcon cat# 352340 Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27 Reagent Invitrogen 17504-044 B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax Reagent Invitrogen 35050-061 Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.

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References

  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
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Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).More

Harris, J., Lee, H., Tu, C. T., Cribbs, D., Cotman, C., Jeon, N. L. Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (8), e305, doi:10.3791/305 (2007).

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