Förbereda E18 kortikala Råtta Nervceller för uppdelning i en mikroflödessystem enhet

Summary

I denna video visar vi utarbetandet av E18 kortikala Rat nervceller.

Abstract

I denna video visar vi utarbetandet av E18 hjärnbarken råtta nervceller. E18 kortikala råtta neuron erhålls från E18 fostrets råtta cortex tidigare dissekeras och förberedd. E18 cortex är på dissektion, omedelbart skiljas i enskilda nervceller. Det är möjligt att lagra E18 hjärnbarken i Hibernate E buffert innehållande B27 vid 4 ° C i upp till en vecka innan dissociation utförs. Däremot kommer det att finnas en droppe i cellernas livskraft. Vanligtvis får vi vår E18 Cortex färsk. Det transporteras till labbet i iskallt Kalcium gratis Magnesium gratis dissektion buffert (CMFM). Vid ankomsten är Trypsin läggs till hjärnbarken till en slutlig koncentration av 0,125%. Cortex är sedan inkuberas vid 37 ° C i 8 minuter. DMEM innehållande 10% FBS läggs till hjärnbarken för att stoppa reaktionen. Cortex är sedan centrifugeras vid 2500 rpm i 2 minuter. Supernatanten tas bort och 2 ml av Neural Basal Media (NBM) innehållande 2% B27 (vol / vol) och 0,25% Glutamax (vol / vol) läggs till hjärnbarken som sedan resuspenderas genom att pipettera upp och ned. Därefter är cortex grov-med tidigare brand polerat glas pipetter, alla med en successiv mindre öppning. Efter finfördelande är cortex återigen centrifugeras vid 2500 rpm i 2 minuter. Supernatanten tas sedan bort och hjärnbarken pellets resuspenderas med 2 ml NBM innehåller B27 och Glutamax. Cellsuspensionen leds sedan genom ett 40 um nylon cell sil. Nästa cellerna räknas. Nervceller är nu redo för påfyllning av neuron mikroflödessystem enhet.

Protocol

Förbereda E18 Fostrets Råtta kortikala nervceller för fack

Innan du börjar är det viktigt att värma upp alla nödvändiga medier och reagenser till 37 ° C.

Det är också viktigt att sterilisera allt som används för att förbereda celler (t.ex. gummi glödlampor, rör rack, media flaskor, etc.), och det som är placerad i huven, genom att torka ner med 70% etanol.

1. Placera två bitar av E18 Fostrets Råtta Cortex (en hjärna, som tidigare dissekerat) i ett 15 ml rör som innehåller 1 ml iskall kalciumfri Magnesium-fria dissektion buffert.
2. Tillsätt 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA till cortex i dissektionen buffert, vilket innebär att den slutliga volymen till 2 ml och slutlig Trypsin koncentration till 0,125%.
3. Placera 15 ml röret i 37 ° C vattenbad i 8 minuter.
4. Under denna tid, brand polera 3 glas Pasteur pipetter och bildar successivt mindre öppningar i en biosäkerhet skåp för att bibehålla sterilitet.
5. Efter 8 minuters inkubation av hjärnbarken, tillsätt 10 ml DMEM innehåller 10% FBS till cortex för att hjälpa till att stoppa trypsin reaktionen.
6. Centrifugera 15 ml röret med cortex och DMEM/10% FBS vid 2500 rpm i 2 minuter.
7. I biosäkerhet skåpet, avlägsna supernatanten från cortex med hjälp av ett glas Pasteurpipett med vakuum bifogas. Var noga med att inte störa eller rubba pelleten.
8. Tillsätt 1 ml av NMB till cortex pellets och försiktigt pipettera upp och ner. Det är mycket viktigt att undvika att skapa luftbubblor medan pipeting upp och ner, eftersom luftbubblor kan skada celler genom oxidation.
9. Använd brand-polerade Pasteurpipett med det bredaste öppningen till mal sönder hjärnbarken genom att fästa en steril gummi glödlampa till slutet och pipeting upp och ner 5 gånger, återigen försiktigt så att inte introducera luftbubblor. Fortsätt denna process med de andra två glas pipetter, vardera med en minskad öppning storlek.
10. Efter trituration, centrifugera ner cellerna igen vid 2500 rpm i 2 minuter.
11. Efter centrifugering, återigen bort supernatanten och resuspendera cellpelleten i 2 ml NBM.
12. Filtrera återsuspenderade cellen lösningen genom ett 45 um cell sil.
13. Färga cellerna med Trypan Blå, räknad och laddas i enheterna. Vi lastar typiskt 20 ul av celler per enhet.

Obs: Den slutliga koncentrationen av celler är vanligtvis mellan 2,5 miljoner celler / ml och 8 miljoner celler / ml

Fylla cellerna

När cellerna har räknats är det dags att ladda cellerna i enheten:

1. Ta den tidigare beredda produkter som innehåller NBM i biosäkerhet skåpet för att bibehålla sterilitet.
2. Ta bort överflödigt material från brunnarna med vakuum. Men var noga med att undvika att ta bort allt material - det måste finnas någon media i huvudkanalen.
3. Applicera 20 ul av celler till övre vänstra reservoar av enheten (se diagram om det behövs). Cellerna flöda in i enheten och fäster vid PLL behandlade ytan.
4. Efter lastning, placera apparater som innehåller cellerna tillbaka i en inkubator för 10 minuter så att cellerna att fästa.
5. Efter 10 minuter, fylla reservoarerna med medier och enheter placera tillbaka i inkubatorn.

Discussion

Cell täthet kan varieras beroende på tillämpning. Men sådd primära nervceller vid för låg med en densitet av typiskt leder till celldöd. Beroende på inkubatorn och luftfuktighet, kan media behöva ändras i enheter var 2 till 3 dagar. När du byter media är det viktigt när du har tagit materialet från reservoarer, att aldrig ta bort material från de största kanalerna. Vidare är det bra att placera nya medier i topp brunnar och tillåter lite frisk media att flödet genom enheten och i de viktigaste kanalerna innan du fyller upp alla reservoarer.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NBM	medium	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
E18 rat embryos	Animal			Obtained from pregnant Sprague Dawley Rats. The pregnant rat is sacrificed and the E18 fetal rat pups dissected to obtain the E18 fetal rat cortex.
CMFM dissection buffer HBSS	buffer			ice-cold Calcium-free Magnesium-free dissection buffer HBSS based.
15 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
0.25% Trypsin-EDTA	Reagent	Invitrogen
37˚C water bath
Pasteur pipets		Fisher Scientific		glass
DMEM	medium	Invitrogen
FBS	Reagent	Invitrogen		serum, used at 10% in DMEM
centrifuge				set at 2500 rpm
Trypan Blue		Invitrogen		for counting live/dead cells
BD Falcon Cell Strainer 40 um	Tool	BD Biosciences	Falcon cat# 352340	Available through Fisher Scientific. Fisher catalog# 08-771-1
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.