Summary
وقد سمح لسهولة الوصول لجنين لاجراء تجارب على خارطة مصائر الخلايا باستخدام أساليب عدة ، بما في ذلك فرخ السمان الوهم والتنسيق العلامات صباغة. في هذه المقالة أسلوب واحد نبدي استعدادا البيض الذي تم الأمثل لأوقات طويلة البقاء على قيد الحياة.
Abstract
وقد تم دراسة التنمية ساعد الى حد كبير عن طريق استخدام الجنين الفرخ كنموذج تجريبي. وقد سمح لسهولة الوصول لجنين لاجراء تجارب على خارطة مصائر الخلايا باستخدام أساليب عدة ، بما في ذلك فرخ السمان الوهم والتنسيق العلامات صباغة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح للاضطرابات الجزيئي لأنواع عدة ، بما في ذلك الموضع من البروتين المغلفة الخرز وإدخال الحمض النووي البلازميد في استخدام electroporation البيضة. وقد أسفرت هذه التجارب بيانات هامة عن تطور الجهاز العصبي المركزي والمحيطي. بالنسبة لكثير من هذه الدراسات ، فمن الضروري فتح قشر البيض وreclose دون إقلاق نمو الجنين. يمكن فحص الجنين في مراحل النمو المتعاقبة من خلال إعادة فتح قشر البيض. في حين أن هناك عدة طرق ممتازة لفتح بيض الدجاج ، في هذه المقالة أن نبرهن أن أسلوب واحد وقد الأمثل لأوقات طويلة البقاء على قيد الحياة. في هذا الأسلوب ، والبيض تقع على جانبها ويتم قطع نافذة صغيرة في وعاء. بعد إجراء العملية التجريبية ، يتم استخدام قذيفة لتغطية البيض لمدة تطورها. شريط من البلاستيك الشفاف التي تغمر قشر البيض يحمي الجنين ويساعد على الاحتفاظ الماء خلال الفترة المتبقية من فترة الحضانة. وقد استخدم هذا الأسلوب في بداية يومين من الحضانة وسمح ببقاء عبر العصور الجنينية ناضجة.
Protocol
1. إزالة البيض من الحاضنة
- الحفاظ على 37 درجة مئوية مع رطوبة النسبية 60 ٪ المبينة أعلاه.
- إزالة البيض ؛ بدوره البيض 90 درجة بحيث قاعدة كبيرة تقع الأفقي.
2. المسحة لتعقيم البيض
- تشبع كومة من غير معقمة الشاش مع الايثانول 70 ٪.
- 2-3 استخدام القطع ليصل الى 5 المسحة البيض. عندما تجاهل الشاش هو المتسخة.
3. إعداد موقع إزالة الزلال
- قص ومكان (أ) 1 "س 1" قطعة من البلاستيك الشريط 3M غادر لتوه من قاعدة لحماية المنطقة حيث سيتم رسمها من الزلال.
4. إزالة الزلال
- استخدام نقطة مقصا لجعل ثقب صغير في منتصف الشريط.
- استخدام حقنة سم 10 مع قياس 18 ، 1 بوصة الإبرة ، وحفر ببطء من خلال ثقب الإبرة الذي أدلى به المقص.
- محرك الإبرة أسفل بزاوية 45 درجة مئوية باتجاه الجزء السفلي من البيض.
- إمالة الإبرة نحو المركز ، ووضع 3-4 مل من الزلال.
5. النوافذ
- قطع 3 "× 3" قطعة من الشريط البلاستيك وتمتد لاحتواءه على الجزء العلوي من البيض. تمديد زوايا مربعة حول تاريخ مقربة من السطح الأفقي للبيض ، والحرص على عدم الانسحاب من الصعب جدا. سحب الشريط بحيث يصبح مشددة ضد سطح البيض مع عدم وجود طيات.
- باستخدام زوج من حادة على التوالي 4 مقص تشريح "، وتطور ثقب في أسفل وسط المنطقة التي وضعت الشريط. دليل ببطء أقل شفرة المقص في البيض ويجري التأكد من الحفاظ على نصائح حتى ضد من الداخل القذيفة. النصل مباشرة صوب القاعدة وتبدأ ببطء لقطع قذيفة. انتقل بطريقة عكس اتجاه عقارب الساعة ، وتوقف قبل الوصول إلى مركز أعلى. إزالة مقص وكرر تسير في الاتجاه المعاكس حتى بت صغير فقط من البيض لا تزال تعلق تحقق للتأكد من البويضة المخصبة. اغلاق النافذة.
6. إغلاق وإعادة فتح وختم البويضة.
- قطع حوالي 2-3 "لفترة طويلة قبل 1 / 2" الشريط البلاستيك واسعة واغلاق النافذة حتى تناسبها العودة الى الحفرة التي قطعت. فيستغرقان 1 × 1 "قطعة من الشريط وختم الحفرة التي تم صرفها من البويضة. استخدم ملقط زوج من البيض لاعادة فتح للقيام بأي تلاعب. قطعت عندما كنت على استعداد للعودة إلى حاضنة البيض ، قطعة من الشريط الذي هو كبيرة بما فيه الكفاية لاغلاق النافذة وتغطي كامل السطح الأفقي للبويضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا الأسلوب يسمح لأوقات طويلة البقاء على قيد الحياة بعد التلاعب التجريبية. على سبيل المثال ، سمحت صبغ وضع العلامات دراسات لبقاء E10 أو في وقت لاحق من مصير دراسة الخرائط (1). بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدامها في الدراسات عن electroporation البيضة التي توفر تغيير في مستويات التعبير الجيني والتنمية المطلوبة للشروع في مراحل لاحقة التنموية (2-6). ويمكن استخدام هذه التقنية النوافذ في تركيبة مع أي إجراء يتطلب البقاء بعد التلاعب في الجنين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
