Summary
קלות הנגישות של העובר אפשרה לניסויים למפות גורלות התא באמצעות גישות שונות, כולל חומוס שליו מפלצות וסימון צבע מוקד. במאמר זה אנו מדגים אחד הכנת ביצה שיטה כי כבר מותאם במיוחד פעמים הישרדות ארוכה.
Abstract
המחקר של פיתוח כבר סייעו במידה רבה על ידי שימוש בעובר האפרוח כמודל ניסיוני. קלות הנגישות של העובר אפשרה לניסויים למפות גורלות התא באמצעות גישות שונות, כולל חומוס שליו מפלצות וסימון צבע מוקד. בנוסף, היא מאפשרת הפרעות המולקולרי של מספר סוגים, כולל המיקום של חלבון מצופה חרוזים המבוא של ה-DNA פלסמיד משתמש electroporation אובו. ניסויים אלה הניבו מידע חשוב על התפתחות מערכת העצבים המרכזית ואת הפריפריה. עבור רבים של מחקרים אלה, יש צורך לפתוח את קליפת הביצה ואת reclose זה מביך ללא צמיחה של העובר. העובר ניתן לבדוק בכל שלבי ההתפתחות רצופים על ידי פתיחה מחדש את קליפת הביצה. אמנם יש כמה שיטות מצוין לפתיחת ביצי תרנגולת, במאמר זה אנו להדגים שיטה אחת, כי כבר מותאם במיוחד פעמים הישרדות ארוכה. בשיטה זו, הביצה מוטלת על צדו חלון קטן הוא חתך במעטפת. לאחר הליך הניסוי, הקליפה משמשת כדי לכסות את הביצה למשך הפיתוח שלה. סרט הפלסטיק השקוף שכיסה את קליפת הביצה מגנה על העובר ומסייעת לשמור על הלחות במהלך יתרת תקופת הדגירה. שיטה זו הייתה בשימוש החל שני ימי דגירה ו אפשרה הישרדות לדורותיה עובריים בוגרת.
Protocol
1. הסר ביצים אינקובטור
- שמור על 37 ° C עם לחות יחסית להגדיר מעל 60%.
- הסר את הביצים; להפוך ביצים 90 ° כך בסיס גדול טמון אופקי.
2. ביצים ספוגית לעקר
- להרוות ערימה של גזה לא סטרילי עם אתנול 70%.
- השתמש 2-3 חתיכות ספוגית עד 5 ביצים. בטל כאשר גזה הוא מלוכלך.
3. הכנת הסרת חלבון האתר
- גזור מקום 1 "x 1" נייר דבק פלסטי 3M שמאל רק בסיס כדי להגן על האזור שבו אלבומין יצויר החוצה.
4. הסרת חלבון
- השתמש נקודת זוג מספריים לעשות חור קטן באמצע הקלטת.
- בעזרת מזרק 10 סמ"ק עם מד 18, 1-inch מחט, לאט לקדוח את המחט דרך החור שנעשו על ידי המספריים.
- כונן את המחט כלפי מטה בזווית של 45 מעלות צלזיוס כלפי התחתון של הביצה.
- הטה את המחט לכיוון מרכז ותנסחו 3-4 מ"ל של חלבון.
5. Windowing
- גזור 3 "x 3" חתיכת סרט פלסטיק למתוח אותו כך שיתאים על החלק העליון של הביצה. הרחב את פינות הריבוע סביב קצוות מעוגלים של המשטח האופקי של הביצים, נזהרים שלא למשוך יותר מדי קשה. משוך את הסרט כך שהוא צמוד פני השטח של ביצים עם קפלים לא.
- באמצעות זוג חד ישר 4 "מספריים לנתיחה, טוויסט חור במרכז החלק התחתון של האזור שבו קלטת הוצב. לאט מדריך את הלהב התחתון של המספריים לתוך הביצה להיות בטוח כדי לשמור על עצות אל מול פנים את הקליפה. ישיר את הלהב לעבר בסיס ולאט לאט מתחילים לחתוך את הקליפה. המשך בצורה נגד כיוון השעון, לעצור רק לפני שהגיע למרכז הדף. הסר את המספריים וחזור הולך בכיוון ההפוך עד קצת קטן בלבד של ביצה נשאר מחובר. בדוק כדי לוודא את הביצית מופרית. תסגור את החלון.
6. סגירה, פתיחה מחדש ואיטום הביצה.
- חותכים כ 2-3 "ארוך על ידי 1 / 2" סרט פלסטי רחב סגר את החלון, כך שהוא מתאים בחזרה לתוך החור הזה נחתך. קחו עוד 1 x 1 "חתיכת קלטת את החור שממנו ביצה היה סחוט. השתמש זוג מלקחיים לפתוח מחדש את הביצה לעשות את כל המניפולציות. כאשר אתה מוכן להחזיר את ביצי אל האינקובטור, לחתוך חתיכה של סרט כי הוא גדול מספיק כדי לאטום את החלון לכסות את המשטח האופקי שלם של הביצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטה זו מאפשרת פעמים הישרדות ארוכה בעקבות מניפולציות ניסיוני. לדוגמה, צבען תיוג מחקרים מותר הישרדות E10 או במאוחר במחקר גורל מיפוי (1). בנוסף, הוא שימש במשך במחקרים electroporation אובו המספקים שינוי של רמות ביטוי הגנים והפיתוח הנדרשים כדי להמשיך בשלבי ההתפתחות מאוחר יותר (2-6). טכניקה זו חלונאית ניתן להשתמש בשילוב עם הליך הדורש ההישרדות לאחר מניפולציות לעובר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
