Summary
लड़की बटेर chimeras और फोकल डाई लेबलिंग सहित कई दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए सेल भाग्य नक्शा भ्रूण की पहुंच में आसानी के प्रयोगों के लिए अनुमति दी गई है. इस अनुच्छेद में हम एक अंडे की तैयारी तरीका है कि लंबे समय अस्तित्व समय के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है प्रदर्शित करता है.
Abstract
विकास के अध्ययन बहुत लड़की भ्रूण के एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में उपयोग के द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है. लड़की बटेर chimeras और फोकल डाई लेबलिंग सहित कई दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए सेल भाग्य नक्शा भ्रूण की पहुंच में आसानी के प्रयोगों के लिए अनुमति दी गई है. इसके अलावा, यह कई प्रकार के प्रोटीन लिपटे मोतियों और ओवो electroporation में प्लास्मिड डीएनए का उपयोग कर की शुरूआत की नियुक्ति सहित आणविक perturbations के लिए अनुमति देता है. इन प्रयोगों मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली के विकास पर महत्वपूर्ण डेटा झुकेंगे है. इन अध्ययनों से कई के लिए, यह आवश्यक है eggshell खुला और यह है भ्रूण विकास perturbing के बिना reclose. भ्रूण eggshell पुनः खोलने के द्वारा लगातार विकास के चरणों में जांच की जा सकती है. जबकि वहाँ चिकन अंडे इस लेख में, खोलने के लिए कई उत्कृष्ट तरीके हैं हम एक तरीका है कि लंबे समय अस्तित्व समय के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है प्रदर्शित करता है. इस विधि में, अंडे अपने पक्ष पर टिकी हुई है और एक छोटी सी खिड़की खोल में कट जाता है. प्रयोगात्मक प्रक्रिया के बाद खोल करने के लिए इसके विकास की अवधि के लिए अंडे को कवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. साफ प्लास्टिक eggshell overlying टेप भ्रूण रक्षा और ऊष्मायन अवधि के शेष के दौरान जलयोजन बनाए रखने में मदद करता है. इस विधि के ऊष्मायन के दो दिनों के में किया गया है शुरुआत इस्तेमाल किया और परिपक्व भ्रूण उम्र के माध्यम से जीवित रहने की अनुमति.
Protocol
1. इनक्यूबेटर से अंडे निकालें
- 37 में बनाए रखें ° सापेक्ष आर्द्रता 60% से ऊपर सेट के साथ सी.
- अंडे निकालें, 90 अंडे बारी ° ताकि बड़े आधार पर क्षैतिज झूठ.
2. झाड़ू से साफ़ करना अंडे के लिए बाँझ
- 70% इथेनॉल के साथ गैर - बाँझ धुंध के ढेर तर.
- 5 अंडे ऊपर झाड़ू दो से तीन टुकड़े का उपयोग करें. त्यागें जब धुंध गंदे है.
3. तैयारी अंडे की सफ़ेदी हटाने साइट
- 3M प्लास्टिक टेप के एक 1 "x 1" टुकड़ा सिर्फ बेस के छोड़ दिया क्षेत्र है जहां albumin तैयार हो जाएगा की रक्षा कट और जगह है.
4. अंडे की सफ़ेदी के निकालना
- कैंची की एक जोड़ी के लिए टेप के बीच में एक छोटा सा छेद कर के बिंदु का उपयोग करें.
- एक गेज-18, 1 इंच सुई के साथ एक 10 सीसी सिरिंज का उपयोग धीरे धीरे कैंची द्वारा बनाई गई छेद के माध्यम से सुई ड्रिल.
- सुई अंडे के नीचे की ओर 45 डिग्री सेल्सियस कोण पर नीचे ड्राइव.
- सुई को केंद्र की ओर झुकाएँ और अंडे की सफ़ेदी के 3 से 4 एमएल आकर्षित.
5. Windowing
- एक 3 "x 3" प्लास्टिक टेप के टुकड़े काटें और यह खिंचाव अंडे के शीर्ष पर फिट है. अंडे की क्षैतिज सतह के गोल समाप्त होता है के आसपास वर्ग के कोनों बढ़ाएँ, सावधान किया जा रहा करने के लिए खींच नहीं भी मुश्किल है. टेप खींचो इतना है कि यह कोई सिलवटों के साथ अंडे की सतह के खिलाफ तंग है.
- तेज सीधे 4 "विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी का उपयोग, क्षेत्र है जहां टेप रखा गया था के नीचे केन्द्र में एक छेद मोड़ धीरे धीरे अंडे में कम कैंची की ब्लेड गाइड करने के लिए सुझावों के अंदर के खिलाफ रखने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है. खोल. आधार की ओर ब्लेड प्रत्यक्ष और धीरे धीरे खोल में कटौती शुरू एक काउंटर दक्षिणावर्त फैशन में आगे बढ़ें. शीर्ष केंद्र तक पहुँचने से पहले ही रोक कैंची निकालें और केवल एक छोटा सा जब तक विपरीत दिशा में जा रहा दोहराने. अंडा रहता है संलग्न यकीन है कि अंडे निषेचित है की जाँच करें. विंडो रहो.
6. बंद, फिर से खोलने और अंडे सील.
- विस्तृत प्लास्टिक टेप "1 / 2 लंबी" एक 2-3 के बारे में काटें और खिड़की बंद तो यह काट दिया गया है कि छेद में वापस फिट बैठता है. एक और 1 x 1 टेप के "टुकड़ा ले लो और छेद से जो अंडे सूखा था मुहर संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें अंडे के लिए किसी भी जोड़तोड़ कर फिर से खोलना. जब आप अंडे इनक्यूबेटर करने के लिए वापसी के लिए तैयार कर रहे हैं, एक टुकड़ा काट टेप है कि काफी बड़ी खिड़की मुहर और अंडे की पूरी क्षैतिज सतह को कवर है.
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Discussion
इस विधि प्रयोगात्मक अभिव्यक्ती के बाद लंबे समय अस्तित्व समय के लिए अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, डाई लेबलिंग अध्ययन E10 या बाद में एक भाग्य मानचित्रण अध्ययन (1) में अस्तित्व की अनुमति दी. इसके अलावा, यह ओवो electroporation अध्ययन है कि जीन की अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन और आवश्यक विकास के बाद विकास के चरणों (2-6) के लिए आगे बढ़ना प्रदान के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह गवाक्षन तकनीक किसी भी प्रक्रिया है कि भ्रूण के लिए जोड़तोड़ के बाद अस्तित्व की आवश्यकता के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
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- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
