Summary
Легкость доступа к эмбрион позволило эксперименты по карте ячейки судьбы, используя несколько подходов, в том числе куриных перепела химеры и координационные маркировке краской. В этой статье мы показываем, одно яйцо подготовки метод, который был оптимизирован в течение долгого времени выживания.
Abstract
Изучение развития был значительно способствовало использование куриного эмбриона в качестве экспериментальной модели. Легкость доступа к эмбрион позволило эксперименты по карте ячейки судьбы, используя несколько подходов, в том числе куриных перепела химеры и координационные маркировке краской. Кроме того, оно позволяет для молекулярных возмущения нескольких типов, в том числе размещение белка покрытием бисером и введение плазмидной ДНК с использованием в ово электропорации. Эти эксперименты были получены важные данные о развитии центральной и периферической нервной систем. Для многих из этих исследований, необходимо, чтобы открыть яичной скорлупы и повторного его, не возмущающие роста эмбриона. Эмбриона могут быть рассмотрены на последующих стадиях развития путем повторного открытия яичной скорлупы. Хотя Есть несколько отличных методов для открытия куриных яиц, в этой статье мы покажем один метод, который был оптимизирован в течение долгого времени выживания. В этом методе, яйцо лежит на боку и маленькое окошко режется в оболочке. После экспериментальной процедуры, оболочка используется для покрытия яйца в течение всего срока его развития. Прозрачная пластиковая лента вышележащих яичная скорлупа защищает эмбрион и помогает сохранить увлажнение в течение оставшейся части инкубационного периода. Этот метод был использован, начиная с двух дней инкубации и позволило выживание через зрелые эмбриональных возрастов.
Protocol
1. Удалить яйца из инкубатора
- Поддерживать при 37 ° С при относительной влажности установлен выше 60%.
- Удалить яйца; свою очередь, яйца 90 ° так, чтобы большая база лежит горизонтально.
2. Тампон яйца для стерилизации
- Пропитайте стек нестерильных марлевых с 70% этанола.
- Используйте 2:58 штук тампоном до 5 яиц. Отменить когда марли загрязнен.
3. Подготовка сайта белка удаления
- Вырезать и место 1 "х 1" кусок ленты 3М пластиковые только что вышли из базы для защиты района, где альбумин будет длительным.
4. Удаление белка
- Используйте точки ножницы, чтобы сделать небольшое отверстие в середине ленты.
- Использование 10 мл шприц с 18 калибра, 1-дюймовый иглы, медленно дрель иглу через отверстие, сделанное от ножниц.
- Drive иглу вниз на 45 ° C углом к нижней части яйца.
- Наклона иглы к центру и составляет от 3 до 4 мл белка.
5. Windowing
- Отрежьте 3 "х 3" пластиковая лента и растянуть его, чтобы поместиться на верхней части яйца. Расширение углах квадрата вокруг закругленными концами горизонтальной поверхности яйца, стараясь не тянуть слишком сильно. Потяните ленту так, чтобы она плотно прилегает к поверхности яйца без каких-либо складок.
- Используя пару острыми прямыми 4 "ножницы рассечение, твист отверстие в центре нижней части области, где лента была сделана. Медленно руководство нижней лезвие ножниц в яйцеклетку будучи уверенным, держать Советы против внутри оболочкой. Прямой клинок к основанию и медленно начинают резать оболочку. Действовать в направлении против часовой моды, останавливаясь только до достижения верхнего центра. Удалите ножницы и повторить идет в противоположном направлении, пока только маленький кусочек яйцо остается на месте. Проверьте, чтобы яйцеклетка оплодотворяется. Закрой окно.
6. Закрытие, открытие и герметизации яйцо.
- Отрежьте около 2-3 "длиной 1 / 2" широкой лентой пластика и закрыть окно, поэтому он подходит обратно в дыру, которая была вырезана. Возьмите еще 1 х 1 "кусок ленты и печатью отверстие, из которого яйцо было осушено. Используйте пару щипцов возобновить яйцо делать какие-либо манипуляции. Когда вы будете готовы вернуться яйца в инкубатор, вырезать кусок ленты, достаточно большой, чтобы запечатать окна и охватывают всю горизонтальную поверхность яйца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод позволяет в течение долгого времени выживания следующих экспериментальных манипуляций. Например, краска маркировки исследования позволили выживание E10 или поздно в исследование судьбы отображения (1). Кроме того, он был использован для исследований в ово электропорации, которые обеспечивают изменение уровня экспрессии генов и развитие необходимых для перехода к поздних стадий развития (2-6). Это оконная техника может быть использована в сочетании с какой-либо процедуры, которая требует выживаемость после манипуляций с эмбрионом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
