Summary
A facilidade de acesso do embrião tem permitido experimentos para mapear destinos célula usando várias abordagens, incluindo pintinho de codorna quimeras e rotulagem corante focal. Neste artigo vamos demonstrar um método de preparação de ovo que foi otimizado para os tempos de sobrevivência a longo.
Abstract
O estudo do desenvolvimento foi muito facilitada pelo uso do embrião de galinha como modelo experimental. A facilidade de acesso do embrião tem permitido experimentos para mapear destinos célula usando várias abordagens, incluindo pintinho de codorna quimeras e rotulagem corante focal. Além disso, permite a perturbações molecular de vários tipos, incluindo a colocação de proteína revestido contas ea introdução de DNA plasmídeo usando em eletroporação in ovo. Esses experimentos produziram dados importantes sobre o desenvolvimento dos sistemas nervoso central e periférico. Para muitos desses estudos, é necessário para abrir a casca de ovo e religar-lo sem perturbar o crescimento do embrião. O embrião pode ser examinada em sucessivos estágios de desenvolvimento de re-abertura da casca de ovo. Apesar de existirem vários métodos excelentes para a abertura de ovos de galinha, neste artigo vamos demonstrar um método que foi otimizado para o tempo de sobrevivência longa. Neste método, o óvulo fica do seu lado e uma pequena janela é cortado no shell. Após o procedimento experimental, a casca é usada para cobrir o ovo para a duração do seu desenvolvimento. Fita plástica que recobre a casca do ovo protege o embrião e ajuda a manter a hidratação durante o restante do período de incubação. Este método tem sido utilizado início em dois dias de incubação e permitiu a sobrevivência através madura idades embrionárias.
Protocol
1. Retire os ovos da incubadora
- Manter a 37 ° C com umidade relativa acima de 60% definido.
- Retire os ovos, vire ovos 90 ° para que a grande base está horizontal.
2. Ovos cotonete para esterilizar
- Saturar uma pilha de gaze não esterilizada com etanol 70%.
- Use 2-3 peças de algodão até 5 ovos. Descartar quando a gaze está suja.
3. Site remoção preparando albumen
- Cortar e colocar um 1 "x 1" pedaço de fita plástica 3M acaba de sair da base para proteger a área onde a albumina será retirado.
4. Remoção de albumina
- Use a ponta de uma tesoura para fazer um pequeno buraco no meio da fita.
- Usando uma seringa de 10 cc com um calibre 18, de 1 polegada agulha, lentamente broca a agulha através do orifício feito pela tesoura.
- Disco a agulha para baixo em um ângulo de 45 ° C para a parte inferior do ovo.
- Inclinação da agulha em direção ao centro e elaborar 3-4 mL de albumina.
5. Windowing
- Corte um 3 "x 3" pedaço de fita plástica e esticá-la para caber no topo do ovo. Estender os cantos da praça em torno das extremidades arredondadas da superfície horizontal dos ovos, tomando cuidado para não puxar demasiado duro. Puxe a fita para que ele seja apertado contra a superfície dos ovos sem dobras.
- Usando um par de sharp-reta quatro tesouras "dissecação, torcer um buraco no centro inferior da área onde a fita foi colocada. Lentamente orientar a menor lâmina da tesoura no ovo certificando-se de manter as pontas para cima contra o interior do o shell. direto a lâmina para a base e, lentamente, começam a cortar a casca. Prossiga de forma anti-horário, parando pouco antes de chegar ao centro da parte superior. Remover a tesoura e repita indo na direção oposta até que apenas uma pequena porção do ovo permanece ligado. Certifique-se o óvulo é fertilizado. Feche a janela.
6. Encerramento, reabertura e selando o ovo.
- Cortar cerca de um 2-3 "de comprimento por 1 / 2" fita plástica de largura e fechou a janela para que ele se encaixa de volta para o buraco que foi cortada. Tomar outro 1 x 1 "pedaço de fita e selar o buraco do qual o óvulo foi drenado. Use uma pinça para reabrir o ovo para fazer quaisquer manipulações. Quando você estiver pronto para retornar os ovos para a incubadora, corte um pedaço da fita que é grande o suficiente para selar a janela e cobrir toda a superfície horizontal do ovo.
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Discussion
Este método permite a sobrevivência a longo vezes seguintes manipulações experimentais. Por exemplo, tintura de rotulagem estudos permitiram a sobrevivência de E10 ou mais tarde, em um estudo de mapeamento de destino (1). Além disso, ela tem sido usada para estudos de eletroporação in ovo que fornecem alteração dos níveis de expressão de genes e desenvolvimento necessário para avançar para estágios mais avançados de desenvolvimento (2-6). Esta técnica de janelas pode ser usado em combinação com qualquer procedimento que requer a sobrevivência após manipulações para o embrião.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotating incubator | Profi | Maintain at 37° Degrees with relative humidity set above 60% | ||
| 70 % EtOH | ||||
| gauze | ||||
| 3M plastic tape | ||||
| 10cc syringe | 1/egg | |||
| 18G needles | 1½ inch needle, 1/syringe | |||
| Dissection scissors | 4" sharp straight blades | |||
| Fertilized Eggs |
References
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).
- Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).
- Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).
- Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).
- Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).
