Summary
ويقدم وسيلة لتحديد الآلية المناسبة اللوني تفاعل مسعور (HIC) وسائل الاعلام لاستخدامها في عملية تنقية البروتين. أسلوب يستخدم لاللوني السائل المتوسطة بما في ذلك الضغط نظام مزج العازلة الآلي، وحقن الديناميكية حلقة العينة، واختيار عمود متسلسلة، وتحليل متعدد الطول الموجي، وجمع الانقسام شطافة الكسر.
Abstract
وعلى النقيض من الأساليب الكروماتوجرافى أخرى لتنقية البروتينات (مثل هلام الترشيح، الألفة، والتبادل الأيوني)، مسعور اللوني تفاعل (HIC) يتطلب عادة تحديد التجريبية (ويشار إلى فحص أو "الكشافة") من أجل اختيار أنسب وسيلة الكروماتوغرافي لتنقية بروتين معين 1. الطريقة المعروضة هنا يصف هذا النهج آلية لاستطلاع للاعلامية الائتلاف المثلى لاستخدامها في تنقية البروتين.
التحالف الدولي للموئل يفصل البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى من المحللة الخام على أساس الاختلافات في hydrophobicity. مشابهة لاللوني تقارب (AC) والتبادل الأيوني اللوني (يتم خصم المبلغ المخصص)، الائتلاف قادر على التركيز على البروتين من اهتمام لأنها تقدم من خلال عملية الكروماتوغرافي. البروتينات الأنسب لتنقية من قبل التحالف الدولي للموئل وتشمل هذه المناطق مع سطح مسعور وقادرة على تحمل التعرض لتركيزات الأملاح الزائدة من الذخيرة م 2nium كبريتات ((NH 4) 2 SO 4). غالبا ما يتم اختيار التحالف الدولي للموئل كوسيلة من وسائل تنقية للبروتينات التي تفتقر إلى علامة الألفة، وغير مناسبة وبالتالي لميلان، وعندما يتم خصم المبلغ المخصص لم يقدم تنقية كاف. الأنصاف مسعور على سطح البروتين ربط مؤقتا ليجند غير القطبية بالإضافة إلى مصفوفة، خامل غير متحرك. التفاعل بين البروتين ويجند تعتمد اعتمادا كبيرا على تركيز الملح من المنطقة العازلة التي تتدفق من خلال العمود اللوني، مع تركيزات عالية الأيونية تعزيز التفاعل البروتين يجند وجعل بروتين ثابت (ملزمة أي داخل العمود) 2. كما انخفاض تركيز الملح، والتفاعل البروتين يجند تبدد، وبروتين يصبح مرة أخرى متنقلة وelutes من العمود. وسائل الاعلام الائتلاف عدة متاحة تجاريا في مخلوط مسبقا الأعمدة، كل واحد يحتوي على عدة من يغاندس مسعور (مثل S-بوتيل، بوتيل، الأوكتيل، وفينيل) عبر ربط في كثافة متفاوتة على حبات الاغاروز من المواصفاتIFIC قطرها 3. عمود الآلي الكشفية يسمح لنهج فعال لتحديد التي ينبغي استخدام وسائل الاعلام عن مستقبل التحالف الدولي للموئل، والتجارب التحسين أكثر شمولا وتنقية البروتين يعمل 4.
بروتين معين يتم تنقيتها هنا هو المؤتلف ببروتين أخضر (GFP)، ومع ذلك، يمكن تكييفها لنهج لتنقية البروتينات الأخرى مع واحد أو أكثر من المناطق سطح مسعور. GFP بمثابة بروتين نموذجا مفيدا، نظرا لاستقرارها، فريد ذروة امتصاص الضوء في 397 نانومتر، ومضان عندما تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية 5. وقد أعدت المحللة البكتيرية التي تحتوي على نوع البرية GFP في منطقة عازلة عالية من الملح، وتحميلها في المتوسط DuoFlow بيو راد نظام الضغط اللوني السائل، وكثف إلى الأعمدة التي تحتوي على وسائل الاعلام HiTrap الائتلاف الائتلاف المختلفة. وكان مزال البروتين من الأعمدة وتحليلها بواسطة خط في وسائل الكشف عن مرحلة ما بعد التشغيل. مزج العازلة، ودينامية حقن حلقة العينة، والعقيد تسلسليزيادة umn اختيار، وتحليل متعدد الطول الموجي، وجمع جزء انقسام شطافة وظيفة للنظام واستنساخ المنهج التجريبي.
Protocol
1. العازلة وإعداد العينات
- الملاحظة الفنية: جميع المخازن المبردة ويجب أن يكون يجب أن يتم تنفيذ كل خطوة من هذا البروتوكول على الجليد أو في درجة مئوية 4، ما لم يذكر خلاف ذلك. درجة الحرارة منخفضة أمر ضروري لمنع تدهور من البروتين ليكون منقى، وضمان ظروف التشغيل الأمثل. وسائل الاعلام قد تسفر عن نتائج الفصل الائتلاف مختلف اذا كانت تعمل عند درجة حرارة الغرفة، وينبغي تشغيل النظام اللوني في مربع 4 C غرفة باردة أو باردة درجة.
- تحضير 500 مل من المخازن المؤقتة التالية: 200 ملي ناه 2 PO 4 (الواق A1)، و 200 مم نا 2 هبو 4، (الواق A2)، و 4.8 M (NH 4) 2 SO 4 (B2 عازلة). وسيتم أيضا ماء منزوع الأيونات (B1 العازلة) يمكن استخدامها. ديغا المخزن المؤقت لضمان أفضل ظروف التشغيل الكروماتوغرافي. سوف الاقصى نظام مزج معا المخازن A1 و A2 لتوليد شطف الفوسفات قليل الملح العازلة، وسوف مزيج المخازن B1 و B2لتوليد كبريتات الامونيوم عالية من الملح العازلة بداية (2.4 M (NH 4) 2 SO 4).
- تحضير 20 مل من العينة إلى أن يتم تحميل عن طريق خلط 10 مل من المحللة الخلية التي تحتوي على البروتين ليكون منقى مع 10 مل من B2 العازلة. ينبغي للكبريتات الامونيوم نهائي تركيز العينة حل الخلية المحللة يكون ما يقرب من 2.4 متر (NH 4) 2 SO 4، مما يجعلها مساوية تقريبا لبدء العازلة. يمكن إعداد المحللة الخلية البكتيرية بواسطة resuspending بيليه في الخلية العازلة الشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0)، يليه صوتنة أو إضافة 1 ملغ / مل الليزوزيم والطرد المركزي في 3700 × ز لمدة 10 دقائق.
- تصفية الخليط المحللة العازلة من خلال بروتين منخفض الربط 0.45 ميكرون حقنة مرشح لإزالة الجسيمات من الحل. الحفاظ على عينة على الجليد حتى انها مستعدة ليتم تحميلها في النظام.
2. الإعداد البدني والسباكة من النظام اللوني DuoFlow
- ضمان كل قوة الجهاز ويتم إجراء اتصالات اتصالات. وينبغي أن الأجهزة تكون واضحة في برنامج بيولوجي اللوني نافذة DuoFlow التحكم اليدوي. يتم سرد موجز للأجهزة في الجدول رقم 1. مثال على نظام السباكة والرسم البياني في الشكل 2.
- نعلق التوصيلات الكهربائية لصمامات للمنافذ مضخة الاقصى محطة العمل ومثل هذا النظام أن ترقيم المنفذ يلي تسلسل منطقي. تسمية كل صمام مع رقم المنفذ منها كمرجع في المستقبل. محطة عمل المضخة والاقصى بمثابة نظام الاتصالات الاتصالات الرئيسي بين الكمبيوتر / وحدة تحكم والنظام اللوني. وسيتم التعرف تلقائيا على الصمامات وعرضها في البرنامج عند توصيله إلى أي جهاز.
- الملاحظة الفنية: على الرغم من تشغيل النظام اللوني في الوضع اليدوي، يتم التحكم في الصمامات بشكل مستقل. رعاية للتحقق من أن يتم تكوين مسار تدفق المرجوة، لا سيما عندما تبديل الصمامات، وقبل الشروع في برتقاليإيه تدفق.
- غمر تفلون أنابيب إلى المخازن A1، A2، B1 و B2. ضمان كميات كافية من العازلة متاحة للبروتوكول كامل وأن أنابيب ستظل المغمورة. ويستعد 500 مل من المخازن المؤقتة A1، A2، و B2 و 1 لتر من B1 الواق تكون كافية.
- عينة راسيا تحميل صمام وديناميكية حلقة عينة كما هو موضح في الشكل (2) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ربط حلقة عينة إلى عينة مدخل صمام (المركز 3) باستخدام طول أنابيب أصغر ممكن. وهذا سيقلل تخفيف عينة خلال عينة عملية التحميل.
- تقليل طول أنابيب بين العينة، عينة مضخة التحميل، ومدخل عينة صمام التحميل (المركز 2). هذا سوف تقلل من كمية عينة اللازمة لتحميل حلقة عينة.
- تحضير 8 ازواج الحجم مماثل من "1/16 أنابيب PEEK التطوير التنظيمي، مع كل زوج انضمت معا من قبل الاتحاد 1/4-28 الإناث female-to-1/4-28. توصيل أزواج لمواقف 1-8 من العمود الثاني صمامات اختيار. الاتحاد 7ق متصلا في سطر إلى مواقف عمود صمام اختيار 2-8 في وقت لاحق وسوف تحل محلها أعمدة اللوني لفحصها. وسيتم الحفاظ الاتحاد المضمنة المرتبطة الوظيفة (1) باعتباره العمود اللوني الالتفافية.
- ملاحظة فنية: تأكد من توصيل كل زوج من الأنابيب لنفس الموقف في كل من صمامات اختيار عمود.
- بدوره على كل من الأشعة فوق البنفسجية 4-طول الموجة / الكاشف فيس (QuadTec) مصباح وثابت الطول الموجي 280 نانومتر مصباح كاشف للأشعة فوق البنفسجية. موجات يمكن قياسها من خلال QuadTec لهذا البروتوكول وتشمل 214 نانومتر، NM 280، و 397 نانومتر. قياس 280 نيوتن متر مع كل من كاشف للأشعة فوق البنفسجية الثابتة الطول الموجي وQuadTec يقدم التكرار النظام ويضمن صحة البيانات.
- ومعايرة جميع أجهزة الكشف عن تأكيد لكل إرشادات الشركة المصنعة. المنظم احداهما هو ضروري للحد من تراكم الهواء فقاعة في كشف ويجب تثبيتها أسفل تيار من أجهزة الكشف ولكن ما يصل تيار من رصد درجة الحموضة.
- النظام المعروضة هنا تضم اثنين من fractioجامعي ن، الذي يوفر راحة كبيرة للتحليل شطافة آخر المدى. نعلق جامعي جزء، صمام تيار الخائن، والخائن وحدة تحكم كما هو موضح في الشكل رقم 2. وسوف جامع جزء متصلا الموضع 1 من صمام الخائن جمع الكسور شطافة 900 ميكروليتر في 12 مل من أنابيب ثقافة، في حين جمع جزء متصلا موقف 2 وجمع 100 الكسور شطافة ميكرولتر في 96 لوحات microtiter جيدا.
- ويتم تشغيل مجمع المركز جزء 2، الخائن صمام، وتحكم الخائن حاليا من محطة العمل اللوني. ويرد وحدة تحكم الخائن داخل المضخة بيو راد فندق Econo التدرج، ولكن لم يتم استخدام مضخة مكون من الجهاز. سيتم عرض "سبليت٪" وضع الخيار على مضخة التدرج فندق Econo عند توصيل صمام الخائن لذلك.
- سبليت٪ إلى 10 مجموعة. وسوف جامع المركز جزء 1 جمع 90٪ من شطافة (900 ميكروليتر / جزء)، وجامع المركز جزء 2 جمع سوف10٪ (100 ميكروليتر / جزء). فإن هواة جمع جزء تقدم في تزامن السماح لأرقام جزء من كل من هواة جمع لتتوافق مع بعضها البعض.
- استبدال جزء جامع معيار رأس قطرة في جزء جامع موقف 2 مع رئيس انخفاض microplate. رئيس انخفاض microplate وأصغر فتحة، والذي يسمح بجمع الأحجام انخفاضا بنسبة 50٪ أصغر (أي 25 ميكرولتر بدلا من معيار ميكرولتر 50) ومفيد على نحو خاص عندما جمع الكسور ≤ 500 ميكروليتر.
- باستخدام لوحة التحكم التي تظهر على الشاشة، تعيين جامع المركز جزء 2 إلى جمع الكسور في جيد-96 لوحات ومقدما بمعدل عينة من 1 / دقيقة. سيتم بدء تشغيل وحدة تحكم الخائن وجامع المركز جزء 2 على الفور يدويا بعد بدء تشغيل اللوني الأول.
- مسح جامع المركز جزء 2 و microplate رئيس قطرة مع B1 العازلة.
3. خطوط النظام فتيلة، برمجة طريقة التشغيل، وEquilibratجي أعمدة التحالف الدولي للموئل
- مع خطوط نظام مدخل الاقصى المغمورة في المخازن degassed A1، A2، B1، ورئيس وB2 مضخات محطة العمل، شطف حلقة العينة، وطرد النظام اللوني في تعليمات الشركة الصانعة. كاملة خطوة فتيلة مع جميع مداخل الاقصى نظام 4 (A1، A2، B1، و B2)، من أجل إزالة فقاعات الهواء المتبقية.
- إعداد نظام التشغيل اليدوي يتطلب من وحدة تحكم النظام عبر برنامج بيولوجي. تأكيد الموضع الصحيح من صمام تحميل عينة وصمامات اختيار عمود قبل بدء تدفق العازلة.
- الاستعداد لبدء دليل 1 مل / دقيقة من تدفق العازلة شطف (0٪ B) من خلال النظام، كما هو موضح في خطوات 3،4-3،5.
- في إطار الإعداد لبرنامج بيولوجي البرامج، حدد "استخدام مزج الاحتياطي" و "مخزن الفوسفات مع كبريتات الامونيوم". تأكيد المخازن A1، A2، B1، B2 والمدرجة في إطار الإعداد مماثلة لتلك المعدة.
- يدويا تعيين معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة من عازلة شطف(0٪ B). مراقبة احداهما، الموصلية، اقتفاء أثر الأشعة فوق البنفسجية، ودرجة الحموضة لا تزال ثابتة وضمن حدود التشغيل العادية. شذوذ تشير إلى الهواء أو انسداد عمود التي ينبغي معالجتها قبل المتابعة.
- مسح كل 8 خطوط اختيار عمود مع 5 العازلة شطف مل. القيام بذلك عن طريق وقف تدفق لأول مرة، ووضع كل من صمامات اختيار عمود إلى موقف 2، واستئناف 1 مل / دقيقة تدفق، B. 0٪ كرر لخطوط اختيار عمود في مواقف 3-8.
- 1 ربط أعمدة الائتلاف مل HiTrap إلى مواقف 2-8 الصمامات اختيار عمود. استكمال خطوات 3،8-3،13 مع عمود واحد في وقت واحد. يحيط علما الذي يوضع عمود الائتلاف في اختيار الموقف الذي صمام. يتم سرد موجز لخصائص العمود وسائل الاعلام التحالف الدولي للموئل في الجدول رقم 2.
- اتصال فعلي من الأعمدة GE HiTrap الرعاية الصحية إلى نظام DuoFlow بيو راد يتطلب سلسلة من التجهيزات التي تستخدم 1/4-28، M6، والتجهيزات Luer. إزالة اتحاد يربط بين الوظيفة اختيار العمود 2 الصمامات. Align الحيوي راد والتجهيزات GE للرعاية الصحية كما هو موضح في الشكل (3).
- إرفاق التجهيزات عمود المنبع إلى DuoFlow. تجنب محاصرة فقاعات الهواء في العمود أو عن طريق ربط أنابيب بشدة التجهيزات عمود المنبع لتركيب صمام اختيار المنبع. تشغيل العازلة شطف من خلال التجهيزات حتى يتم طرد كل الهواء وانخفاض كبير من المخزن المؤقت الحالي. توقف مؤقتا تدفق العازلة.
- إزالة سدادة متصلا مدخل عمود ووضع انخفاض كبير من قليل الملح العازلة (0٪ B) على رأس العمود. نعلق العمود إلى التجهيزات المنبع. وجود كل من مدخل عمود وتركيب مدخل تفيض قطرات من عازلة تضمن اتصال خالية من فقاعات الهواء.
- إذا يتم استخدام عمود للمرة الأولى، المفاجئة قبالة نهاية مخرج العمود. إرفاق منفذ إلى التجهيزات عمود المصب واختيار أنابيب صمام. تحقق من يتم تثبيتها بإحكام جميع التجهيزات.
- تعيين الحد احداهما الى 40 PSI. غسل ث العمودإيث حجم العمود 5 (مجلدات العمود 5 = 5 مل) من العازلة شطف (0٪ B) في معدل التدفق من 1 مل / دقيقة. يستمر غسل عمود، إذا لزم الأمر، حتى درجة الحموضة، واقتفاء أثر الأشعة فوق البنفسجية واحداهما استقرت.
- غسل عمود مع حجم العمود 10 (10 مل) من بداية العازلة (100 B٪) في معدل التدفق من 1 مل / دقيقة. يستمر غسل عمود، إذا لزم الأمر، حتى المعلمات النظام المدرجة في الخطوة السابقة، فضلا عن الموصلية قد استقرت.
- العمود الائتلاف مستعد أعلاه هو الآن على استعداد لتحميل عينة. مرة واحدة على استعداد كافة الأعمدة لفحصها، والتبديل يدويا صمامات اختيار العمود إلى الموضع 1 (الاتحاد)، ووقف تدفق العازلة.
4. عينة تحميل
- أنابيب غمر مدخل عينة إلى عينة مل 20 لبدء عملية التحميل من العينة في حلقة نموذج ديناميكي. من إطار الإعداد اليدوي لبرنامج بيولوجي، والتبديل عينة تحميل حلقة / غسل صمام إلى المركز 1 (عينة) وصمام عينة تحميل لتطهير.
- الشروع في اتخاذ إجراءات منلتحميل حلقة مضخة عينة، ووضع عينة في أنبوب مضخة في معدل التدفق من 1 مل / دقيقة حتى فورا بعد عينة تصل إلى صمام تحميل عينة. هذا يزيل العازلة و / أو الهواء من عينة خط الحمل.
- وقف تدفق المضخة التحميل وتبديل صمام التحميل عينة من التطهير إلى تحميل. إعادة تحميل حلقة مضخة عينة في معدل التدفق من 1 مل / دقيقة حتى تم وضع 10 مل من العينة في حلقة نموذج ديناميكي.
- الآن يتم تحميل عينة كافية في حلقة عينة ديناميكية لتصل إلى 10 أشواط متتالية عمود الائتلاف الكشفية.
5. برمجة البرامج وطريقة تشغيل بروتوكول العمود الكشافة
- من إطار الإعداد على برنامج بيولوجي، وحدد نظام الأجهزة التي تحمل علامة النجمة في الجدول رقم 1.
- حدد 6 أعمدة التحالف الدولي للموئل إلى فحص. برنامج التدرج الخطي ملح الهابطة و 6 أعمدة طريقة الكشفية، كما هو موضح في الجدول رقم 3. هذا البرنامج هو طريقة modificatوقد تم تحسين ايون لإعداد برنامج بيولوجي عمود الائتلاف وللتطبيق الحالي.
- ينصح أسلوب 6 عمود الكشفية بسبب القيود جمع جزء. ويمكن كل أعمدة 7 مزدرى إذا تم تعديل طريقة برنامج لجمع كميات أكبر جزء. لا تقم بإضافة خطوة الكشفية حتى اكتمال برنامج خلاف ذلك، كما اختيار ميزة الكشفية يمنع التحرير اللاحقة.
- تبدأ على المدى الكشفية. بدء يدويا العازلة بداية (100 B٪) تدفق، 1 مل / دقيقة. اضغط على بدء تشغيل على وحدة تحكم الخائن أن تبدأ من 90٪ -10٪ شطافة تيار تقسيم بين ثقافة مل 12 جامع كسر أنبوب (المركز 1)، وجزء لوحة 96-جيدا جامع (المركز 2)، على التوالي. ملحوظة فنية: تذكروا التي يتم فيها تشغيل جزء لوحة 96-جيدا جامع حاليا من برنامج بيولوجي.
- طريقة تشغيل البرنامج. مباشرة بعد بدء التشغيل طريقة البرنامج، اضغط بدء على لوحة التحكم التي تظهر على الشاشة من لوحة fractio حاليا 96-جيدان جامع. إذا كان هواة جمع جزء 2 ليست 100٪ متزامن، تقدم يدويا حاليا جزء لوحة 96-جيدا جامع مع تقدم جزء جامع أخرى إلى أنبوب جمع جزء الثاني.
- مراقبة عرض في الوقت الحقيقي لتأكيد المعلمات المدى المتوقع. احداهما، الموصلية، و٪ B (الشكل 4) يتم تشغيلها المعلمات التي يمكن رصدها لضمان عمود إلى عمود استنساخ ظروف التشغيل. وينبغي أيضا تحديد المواقع صمام، ودرجة الحموضة، وتحميل عينة يمكن رصدها. ويمكن مقارنة اقتفاء أثر الأشعة فوق البنفسجية للتحقق من التدفق من خلال قمم مماثلة شطف.
- تستخدم في سطر وآخر تديره تقنيات تحليل شطافة لمعرفة الوضع شطف وتنقية هذا البروتين من مصلحة (أي "بروتين الهدف").
- للعينات التي تحتوي على GFP، مراعاة شطف في خط باستخدام امتصاص البروتين والأشعة فوق البنفسجية فريدة من نوعها في 397 نانومتر. مقارنة GFP محددة الامتصاصية 397 نانومتر تتبع لامتصاص البروتين عام 280 نانومتر تتبع لتقدير فصل نسبيومزدرى تنقية باستخدام وسائل الإعلام المختلفة الائتلاف كونه (الشكل 5).
- ويمكن تحقيق ما بعد المدى تحليل GFP والبروتينات المستهدفة الأخرى من خلال أساليب متعددة. ويمكن تحويل Aliquots ميكرولتر من 5-50 من الكسور لوحة 96-جيدا إلى لوحة جديدة ويعاير لمحتوى بروتين معين بواسطة ELISA أو لطخة غربية، ويمكن تحليل إجمالي محتوى البروتين في كل جزء باستخدام التقليدية SDS-PAGE أو Experion نظام ميكروفلويديك الكهربائي. ويمكن الكشف عن GFP مضان في 12 مل من أنابيب ثقافة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الشكل 6).
- ويمكن تحديد هوية معظم وسائل الاعلام من قبل التحالف الدولي للموئل واعدة مقارنة شطف GFP بالنسبة إلى البروتينات الأخرى الواردة في العينة. ويمكن بعد ذلك تنقية مع وسائل الاعلام في التحالف الدولي للموئل الواعدة يكون الأمثل وفقا لمعايير أخرى، بما في ذلك نوع وتركيز العازلة البداية ودرجة الحموضة.
- ملاحظة فنية: وفي ختام التجربة، ووضع جميع الخطوط مدخل إلى B1 العازلة (degassedH 2 O) وبدقة شطف المضخات والصمامات والأنابيب وجميع بالماء. اتبع تعليمات الصانعين لتنظيف وتخزين طويل الأجل للنظام اللوني والأعمدة الائتلاف.
6. ممثل النتائج:
وتقدم ممثل التدرج ملح الائتلاف، الموصلية، وضغط عمود من أشواط الكشفية والارشادية في الشكل 4. التغيير في تركيز الملح (الخط الأزرق)، إذا ما قيست نسبة العازلة مستمدة من خطوط عازلة عالية من الملح هي الحال في منهجية التحالف الدولي للموئل. كما يقلل من تركيز الملح والبروتينات منضمة إلى أزل عمود. ويتم قياس الموصلية (الخط الأحمر)، والتي تتطابق مع تركيز الملح لوحظ، في الخط مباشرة بعد الكشف عن QuadTec والأشعة فوق البنفسجية. وبعيدا عن وضع التدرج بين الملح واقتفاء أثر الموصلية يدل على الوقت اللازم لعازلة للسفر من مدخل المخزن، من خلال النظام، وإلى رصد الموصلية. طوال الفترة السابقة عينة، تيانه نظام الضغط (خطوط رمادية)، ودرجة الحموضة تظل ثابتة نسبيا.
ويبين الشكل 5 أشواط متتالية من المخططات الاستشرابية عمود الائتلاف الكشفية. ويتم إنجاز الكشف في سطر من البروتين الكلي (280 الخط الأزرق،) وGFP (A 397 الخط الأخضر،) من خلال قياس امتصاص الضوء عند 280 نانومتر و 397، على التوالي. فمن الممكن لتقريب وفرة نسبية GFP والانفصال عن كل المدى الكشفية من خلال مقارنة هذين الخطين. GFP منضمة إلى أعمدة الائتلاف اختبار مع درجات مختلفة من التقارب ومكانتها شطف متنوعة. ويستند اختيار عمود الائتلاف المفضل لالتنقيات في المستقبل على تحديد العمود الذي ينتج شطف أكبر وأعظم GFP ذروة فصل من البروتينات الأخرى.
في الشكل (6)، وأنابيب للثقافة الكسور 10، 12، 14، 16، و 18 من FF فينيل (شبه عالية) الكشفية المدى كانت تصور غرفة تحت المحيط (فلوري) الضوء وجداالبنفسجي (UV) ضوء. واعتبرت كل من أنابيب وجها إلى الأمام (لوحات اليسار) وأعلى إلى أسفل (لوحات اليمين) من أجل مراقبة الانبعاثات GFP مميزة طيف. تم الكشف بوضوح GFP (الخضراء) في الكسر 14 في كل من صور الأشعة فوق البنفسجية. هذه البيانات في مرحلة ما بعد المدى تتوافق بشكل جيد مع الكشف في سطر من GFP عن طريق قياس الامتصاصية في 397 نانومتر شطافة (A 397 الخط الأخضر،)، والذي يحدد أيضا الكسر 14 على النحو الذي يحتوي على قمة كبرى من GFP مزال. ينبعث الضوء الأزرق منتشر في لوحة للأشعة فوق البنفسجية اليسار من مصباح الأشعة فوق البنفسجية.
الشكل 1. التمثيل التخطيطي لهذا البروتوكول. يتم إعداد المحللة البكتيرية التي تحتوي على البروتين من الفائدة (GFP، البروتين الهدف)، مخففة إلى ما يعادل العازلة عالية من الملح إلى اللوني العازلة البداية، والتي تمت تصفيتها. بعد الانتهاء من إعداد النظام اللوني السائل، يتم تحميل العينة ويتم فصل بروتين الهدف من البروتينات الأخرى الواردة أنان والمحللة باستخدام وسيلة اللوني مسعور الواردة في عمود مخلوط مسبقا التحالف الدولي للموئل. ويتكرر أسلوب فصل عدة مرات باستخدام وسائل الإعلام المختلفة اللوني (ويشار إلى عمود الكشفية) من أجل تحديد وسائل الإعلام التي توفر أفضل فصل GFP. ويتم تحليل البروتينات مزال (شطافة) في سطر باستخدام أجهزة الكشف عن تضمينها في النظام اللوني، ويتم جمعها إلى أصغر أجزاء لتحليلها (بعد المدى) لاحقة. استنادا إلى تحليل في سطر وآخر المدى من نشاط GFP والانفصال، عمود الأمثل التحالف الدولي للموئل والمتوسطة الكروماتوغرافي يتم تحديدها.
الجدول رقم 1. المكونات الرئيسية لنظام اللوني المستخدم في هذا البروتوكول.
الشكل 2. مخطط من بيو راد DuoFlow المتوسطة ضغط السائل النظام اللوني المستخدمة. الملامح الرئيسية للSYوتشمل وقف الآلي مزج العازلة، وتحميل من عينة ليدير عمود متسلسلة، واختيار الآلية من الأعمدة اللوني مختلفة، في خط تحليل شطافة، وجنبا إلى جنب مجموعة من شطافة مجزأة. انظر النص والجدول رقم 1 لمزيد من التفاصيل.
اختبار الجدول 2. الخصائص البيوفيزيائية من وسائل الإعلام التحالف الدولي للموئل. اسم HiTrap عمود الائتلاف يدل على يجند، كثافة يجند، وحجم حبة.
* FF = تدفق سريع؛ حصان = عالية الأداء. حجم أكبر حبة يزيد من قدرة يجند ملزمة ومعدل التدفق. حجم أصغر حبة يزيد قرار الكروماتوغرافي. المعلومات المستقاة من الكتابات التي توفرها الشركة المصنعة.
الشكل 3. اتصال من العمود GE HiTrap الرعاية الصحية إلى التحالف الدولي للموئل system.To DuoFlow بيو راد المنبع الجوز Delrin 1/4-28 1الثانية الطويق (A1)، وذكر Luer إلى الإناث المناسب 1/4-28 (B1) والذكور 1/16 "إلى الإناث المناسب Luer (C) وترتبط. والتجهيزات ونعلق على العمود HiTrap بعد أن مسح مع عازلة، وبعد كل إزالة الفقاعات. يتم توصيل منفذ عمود إلى الإناث 1/16 "إلى الذكور المناسب M6 (D)، ذكر Luer إلى تركيب M6 الإناث (E)، والإناث 1 Luer إلى الإناث / 4-28 المناسب (ب 2). يرتبط هذا التجمع بأكمله إلى الجوز Delrin 1/4-28 المصب والطويق (أ 2). لوحة العليا ويبين التجهيزات فصل واللوحة السفلى ويبين التجهيزات تجميعها.
| الخطوة # | الحجم (مل) | وصف | المعلمات | |
| 1 | 0.00 | جمع الكسور 1.0 مل أثناء تشغيل كامل | ||
| 2 | 0.00 | Switأعمدة الفصل | التحالف الدولي للموئل العمود 1 (المركز 2) | |
| 3 | 0.00 | Isocratic التدفق | الحموضة: 6.80 100٪ B | حجم: 2.00 مل تدفق: 1.00 مل / دقيقة |
| 4 | 2.00 | صفر خط الأساس | QuadTec | |
| 5 | 2.00 | صفر خط الأساس | الأشعة فوق البنفسجية الكاشف | |
| 6 | 2.00 | حقن عينة | عينة تحميل دينامية حلقة | السيارات حقن صمام حجم: 0.50 مل تدفق: 1.00 مل / دقيقة |
| 7 | 3.00 | Isocratic التدفق | الحموضة: 6.80 100٪ B | حجم: 5.00 مل تدفق: 1.00 مل / دقيقة |
| 8 | 8.00 | التدرج الخطي | الحموضة: 6.80 100٪ B -> B 0٪ | حجم: 10.00 مل تدفق: 1.00 مل/ دقيقة |
| 9 | 18.00 | Isocratic التدفق | الحموضة: 6.80 0٪ B | حجم: 3.00 مل تدفق: 1.00 مل / دقيقة |
| 10 | 21.00 | Isocratic التدفق | الحموضة: 6.80 100٪ B | حجم: 5.00 مل تدفق: 1.00 مل / دقيقة |
| 11 | 26.00 | أعمدة التحول | الاتحاد (المركز 1) | |
| نهاية | 26.00 | نهاية البروتوكول | تكرار تلقائيا مع العمودين 5 HIC إضافية (مواقف 3-7) | |
| نوع الكشفية | عدد أشواط: 6 | مزدرى عدد من الخطوات: 1 | ||
جدول البرامج البيولوجية 3. بروتوكول للتحالف الدولي للموئل طريقة الكشفية المستخدمة.
<IMG ALT = "الشكل 4" SRC = "/ files/ftp_upload/3060/3060fig4.jpg" />
الشكل 4. الممثل ميل ملح التحالف الدولي للموئل، الموصلية، وضغط العمود. كما أن تركيز الملح (الخط الأزرق) النقصان، الموصلية (الخط الأحمر) يفعل كذلك. والمقاصة بين التدرج الملح واقتفاء أثر الموصلية يشير الوقت اللازم لعازلة للسفر من مدخل المخزن المؤقت لشاشة الموصلية. ضغط نظام (خطوط رمادية) يبقى ثابتا نسبيا طوال فترة على المدى الكشفية.
الشكل 5. المخططات الاستشرابية المترجمة متتابعة HiTrap عمود الائتلاف الكشفية أشواط. ويتم إنجاز الكشف في سطر من البروتين الكلي (280 الخط الأزرق،) وGFP (A 397 الخط الأخضر،) من خلال قياس امتصاص الضوء عند 280 نانومتر و 397، على التوالي. في هذه السلسلة من التجارب، لوحظ في شطف أكبر GFP الذروة مع FF فينيل (شبه عالية) جolumn. وFF فينيل (شبه عالية) العمود ظهر أيضا إلى توفير أكبر قدر من الفصل بين GFP والبروتينات الأخرى. اختبار إضافية HiTrap 1 مل أعمدة التحالف الدولي للموئل وشملت فينيل استبدال تدفق سريع المنخفضة (فينيل فرنك فرنسي (دون منخفض))، بوتيل تدفق سريع (بوتيل FF)، بوتيل-S تدفق سريع (بوتيل-S FF)، وتدفق سريع الأوكتيل (الأوكتيل FF) .
الشكل 6. ممثل آخر تديرها تصور GFP في شطافة عينة. وقد تم جمع الكسور شطافة بمعدل 1/minute، وجرى تحليل لمحتوى كل GFP. في هذا الرقم ممثل، وكانت أنابيب للثقافة الكسور 10، 12، 14، 16، و 18 من FF فينيل (شبه عالية) الكشفية المدى تصور غرفة تحت المحيط (فلوري) الضوء وأشعة فوق البنفسجية ضوء. واعتبرت كل من أنابيب وجها إلى الأمام (لوحات اليسار) وأعلى إلى أسفل (لوحات اليمين). ينبعث الضوء الأزرق منتشر في لوحة للأشعة فوق البنفسجية اليسار من مصباح الأشعة فوق البنفسجية. تم الكشف بوضوح GFP (الخضراء) في فاركنشوئها 14 في كل من صور الأشعة فوق البنفسجية. لوحة العليا يدل على البروتين الكلي (A280 الخط الأزرق،) وGFP (A 397، الخط الأخضر) اقتفاء أثر اللوني للكسور 5 كونها تصور.
Discussion
وقد أثبتت أساليب اللوني السائل لا يقدر بثمن لإعداد البروتينات عالي النقاء اللازمة لإجراء 6 المناعية، والكيمياء الحيوية 7، والهيكلية الدراسات 8. طرق تنقية الائتلاف غالبا ما تتطلب تحديد التجريبية من الوسيلة المفضلة، وهيكل يجند، كثافة يجند، وخصائص كل حبة مصفوفة وقد ثبت أن تؤثر على نتائج الكروماتوغرافي 2، 3. عمود الآلي الكشفية هو نهج فعال لاختيار وسيلة التحالف الدولي للموئل لتعظيم الاستفادة اللاحقة وتنقية البروتينات 4. ويمكن للطريقة عمود الآلي الكشفية قدمت تكييفه بسهولة لمختلف استراتيجيات الائتلاف تنقية البروتين. قد تغييرات في تركيز الملح، واختيار من الملح، والانحدار والملح، ودرجة الحموضة زيادة تحسين ظروف تنقية، وجرى آثار متفاوتة هذه المعايير الأساسية التي سبق استعراضها 13،14. التحالف الدولي للموئل شطافة تحتوي على هدف المتواجد النقي جزئياويمكن في تنقية أخرى باستخدام تقنية الكروماتوغرافي التكميلية، مثل التبادل الأيوني اللوني (يتم خصم المبلغ المخصص) أو هلام الترشيح / حجم الإقصاء اللوني 9،10.
بسبب الامتصاصية في ضوء فريد من نوعه وخصائص الانبعاثات، ويمكن التعرف على الشخصية من شطف GFP تستخدم في خط ونهج آخر المدى. تحقيقا لهذه الغاية، ويمكن زيادة هذا البروتوكول يمكن تكييفها لتنقية البروتينات GFP-الانصهار المؤتلف، الذي يتم فيه "الموسومة" وهو بروتين الهدف لا علاقة لها مع GFP. ويمكن الكشف عن البروتينات الهدف GFP-المفتاحية للأشعة فوق البنفسجية 11 و تنقيته باستخدام نهج الكروماتوغرافي المختلفة، بما في ذلك استراتيجية تنقية HIC المذكورة أعلاه. لقد أصبح GFP تنقية أيضا عنصرا أساسيا في مختبرات الكيمياء الحيوية التربوية لتدريس التقنيات الحديثة في علم بروتين 12.
في حين يمكن أن تتم تنقية البروتين الأساسي الائتلاف باستخدام أقل قوة بكثير اللوني SYالجذعية، والأجهزة المعروضة هنا لديها عدد من مزايا واضحة للمساعدة في الحصول على نتائج ايجابية. وتشمل الفوائد تحسين ملحوظ في الاستفادة من وجود نظام تشغيل الآلي للغاية للتشغيل حالة التكاثر، والوقت وفورات، وتناقص فرص الهواء لإدخالها في نظام 10. نظام يسيطر مزج العازلة، التي يسرتها الاقصى نظام، ويسمح لزيادة الاتساق في إعداد العازلة واستنساخ التجارب. رسم كاف تحميل عينة في حلقة عينة الحيوية للجميع الكشفية يدير مزيد من يضمن التوحيد من العينة التي تضاف إلى كل عمود، ويسمح للأشواط متتالية دون انقطاع أو إعادة دليل. تسيطر حقن عينة من حلقة عينة على العمود يقلل التقلبات التي قد تحدث مع تحميل عينة دليل. زوج من الصمامات اختيار العمود السماح لتشغيل عينة على التوالي، باستخدام كل عمود مختلف التحالف الدولي للموئل، دون الحاجة إلى replumb النظام. أداء مول TI-الطول الموجي تحليل مفيد على نحو خاص عندما يعاير بروتين مع التشكيل الجانبي للطيفية فريدة من نوعها. بالإضافة إلى GFP، قد السيتوكرومات، flavoproteins، وغيرها من البروتينات الهيم المحتوية على الاستفادة من هذه التقنية. أجهزة رصد الموصلية، ودرجة الحموضة تسمح للتحقق من الوقت الحقيقي والظروف التجريبية. جمع الانقسام شطافة جزء يسمح للتعامل مع جزء محسنة ويمكن نقلها بسهولة عن طرق تحليل ما بعد المدى والتي تتطلب الحد الأدنى من حجم العينة (على سبيل المثال ELISA، SDS PAGE، طخة غربية، وExperion الكهربائي ميكروفلويديك). في حين تعمل على جمع جزء 2 حاليا يتطلب التزامن اليدوي، فإنه يسمح لأقصى قدر من المرونة في اختيار جامع الكسر. عيوب أهم لاستخدام هذا النظام اللوني قوية لعمود الائتلاف الكشفية وتنقية البروتين وتشمل للمرة الأولى والنفقات في الميزانية المرتبطة حيازة الصك وتدريب المشغلين.
تي "> بروتوكول المعروضة هنا يستخدم لبيو راد النظام اللوني DuoFlow، ومع ذلك، قد تستخدم أيضا أدوات قوية على قدم المساواة من الشركات المصنعة الأخرى، مثل أفانت AKTA من GE للرعاية الصحية، تكون وتكون قادرة على تحقيق نتائج تعادل النظام اللوني للمقارنة حتى لها خصائص فريدة من نوعها (على سبيل المثال أسلوب البرمجة، تسمية عنصر، وتفضيل المشغل، وقابلية القيود) التي ينبغي النظر فيها قبل الشروع في إجراء تنقية أو حيازة الصك.Disclosures
حدد الكواشف اللوني، وقدمت من قبل الأجهزة التكميلية بيو راد.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM086822 ومؤسسة العلوم الوطنية الكبرى منحة بحثية الأجهزة DBI-0960313. فإن الكتاب أود أن أشكر الدكاترة. جون مياكي ودونا هاردي (بيو راد) وجنيفر Loertscher (جامعة سياتل) لخبرتهم التقنية. حدد الكواشف اللوني، وقدمت بسخاء من قبل الأجهزة التكميلية بيو راد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | |
| Diverter valve SV3-2 | Bio-Rad | 7500410 | |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | 7410017 | |
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 74010088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
References
- Cummins, P. M., O'Connor, B. F. Hydrophobic interaction chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).
- Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems. J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).
- To, B. C., Lenhoff, A. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode. J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).
- Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins. Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).
- Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).
- Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).
- Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography. J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).
- Camper, D. V., Viola, R. E. Fully automated protein purification. Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).
- Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms. Protein Sci. 18, 121-133 (2009).
- Wu, Y. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).
- Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).
- McCue, J. T. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).
