Summary
En automatiseret fremgangsmåde til identifikation af egnede hydrofobe interaktions-kromatografi (HIC) medier, der skal anvendes i processen proteinoprensning er præsenteret. Fremgangsmåden anvender en medium-tryk-væskekromatografi, der indbefatter automatiserede puffer blanding, dynamisk prøvesløjfe injektion, sekventiel kolonne, multi-bølgelængde analyse og opdelt fraktion eluat samling.
Abstract
I modsætning til andre kromatografiske metoder til oprensning af proteiner (fx gelfiltrering, affinitetskromatografi og ionbytning), almindeligvis hydrofob interaktionskromatografi (HIC) kræver eksperimentel bestemmelse (benævnt screening eller "spejder") for at vælge den mest egnede chromatografiske medium til oprensning af et givet protein 1. Fremgangsmåden præsenteres her beskriver en automatiseret metode til opdagelse af en optimal HIC medier anvendes til proteinoprensning.
HIC separerer proteiner og andre biomolekyler fra et råt lysat baseret på forskelle i hydrofobicitet. Svarende til affinitetskromatografi (AC) og ionbytningskromatografi (IEX) HIC er i stand til at koncentrere proteinet af interesse, som det skrider frem gennem det chromatografiske proces. Proteiner er bedst egnet til oprensning af HIC indbefatter dem med hydrofob overflade regioner og i stand til at modstå udsættelse for saltkoncentrationer over 2 M ammonium sulfat ((NH4) 2 SO4). HIC er ofte valgt som en fremgangsmåde til oprensning af proteiner, der mangler et affinitetsmærke og dermed uegnede til AC, og når IEX ikke tilvejebringe tilstrækkelig oprensning. Hydrofobe dele på proteinet overfladen midlertidigt bindes til en ikke-polær ligand koblet til en inert, fast matrix. Interaktionen mellem protein og liganden er stærkt afhængige af saltkoncentrationen i pufferen, der strømmer gennem kromatografisøjle med høje ionkoncentrationer styrke protein-ligand-interaktion og gøre proteinet immobile (dvs. bundet til kolonnen) 2. Som saltkoncentrationer fald, protein-ligand-interaktion spredes, proteinet igen bliver mobile og eluerer fra søjlen. Adskillige HIC medier er kommercielt tilgængelige i præ-pakkede søjler, der hver indeholder en af flere hydrofobe ligander (f.eks S-butyl, butyl, octyl og phenyl) tværbundet med varierende massefylder på agaroseperler i en specforsk diameter 3. Automatiseret kolonne scouting giver mulighed for en effektiv metode til at afgøre, hvilke HIC medier bør benyttes til fremtidige, mere udtømmende optimering eksperimenter og proteinoprensning kører 4.
Det specifikke protein, der oprenses her er rekombinant grønt fluorescerende protein (GFP), men kan fremgangsmåden tilpasses til oprensning af andre proteiner med en eller flere hydrofobe overfladeområder. GFP tjener som en nyttig model protein på grund af dets stabilitet, unikke lys absorbanstop ved 397 nm, og fluorescensen, når det udsættes for UV-lys 5. Bakterielysat indeholdende vildtype GFP blev fremstillet i en højsalt-buffer, fyldes i en Bio-Rad DuoFlow medium tryk-væskekromatografi systemet, og adsorberet på HiTrap HIC-søjler, der indeholder forskellige HIC medier. Proteinet blev elueret fra kolonnerne og analyseret ved in-line og post-run detektionsmetoder. Puffer blanding, dynamisk prøvesløjfe injektion, sekventiel colUMN udvælgelse, multi-bølgelængde analyse, og split brøkdel eluatet samling øget funktionalitet af systemet og reproducerbarheden af den eksperimentelle tilgang.
Protocol
1. Puffer og Prøvefremstilling
- Teknisk note: Alle buffere skal være nedkølet og hvert trin af denne protokol skal udføres på is eller ved 4 ° C, medmindre andet er angivet. Den lave temperatur er nødvendig for at forhindre nedbrydning af protein, der skal oprenses, og for at sikre optimale driftsbetingelser. HIC medier kan frembringe forskellige separationsprocesser resultater, hvis drives ved stuetemperatur og chromatografi systemet skal anvendes i et 4 ° C koldt rum eller kolde boks.
- Fremstille 500 ml af følgende puffere: 200 mM NaH 2PO 4 (Buffer A1), 200 mM Na2 HPO4 (Buffer A2) og 4,8 M (NH4) 2 SO4 (Buffer B2). Deioniseret vand (Buffer B1) vil også blive anvendt. Afgasse bufferen for at sikre optimale chromatografiske driftsbetingelser. Systemet Maximizer vil smelte sammen Buffere A1 og A2 til at generere en lav-salt-phosphat elueringsbuffer, og den vil passe Buffere B1 og B2til dannelse af høj-saltet ammoniumsulfat startpuffer (2,4 M (NH4) 2 SO4).
- Fremstille 20 ml af prøven, der indlæses ved at blande 10 ml af cellelysat, som indeholder proteinet, som skal renses med 10 ml buffer B2. Den endelige ammoniumsulfatkoncentration af cellelysatet prøveopløsningen bør være ca 2,4 M (NH4) 2 SO4, hvilket gør det næsten ækvivalent med startpuffer. Cellelysat kan fremstilles ved resuspendering af bakterielle cellepellet i TE-buffer (10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8,0) efterfulgt af sonikering eller tilsætning af 1 mg / ml lysozym og centrifugering ved 3700 x g i 10 minutter.
- Filtrere lysatet-buffer blanding gennem en lav proteinbinding 0,45 um sprøjtefilter at fjerne partikelformigt stof fra opløsningen. Holde prøven på is, indtil den er klar til at blive lastet ind i systemet.
2. Fysisk Opsætning og VVS af DuoFlow Chromatography System
- Sørg for at alle enhedens magt og kommunikation tilslutninger er foretaget. Enheder skal være synlige i den biologiske DuoFlow kromatografi software manuel kontrol vinduet. Et resumé af indretninger er anført i tabel 1. En illustration af systemet og VVS diagram i figur 2.
- Sæt elektriske tilslutninger til ventilerne til pumpen arbejdsstation og system Maximizer porte, således at havnen nummereringen følger en logisk rækkefølge. Mærk hver ventil med dens respektive portnummer for fremtidig reference. Pumpen arbejdsstationen og systemet maksimering er de vigtigste kommunikationsforbindelser mellem computeren / styreenheden og kromatografi-system. Ventiler, vil automatisk blive anerkendt og vises i softwaren, når der sluttes til enheden.
- Teknisk note: Selvom driften af chromatografi-systemet i manuel tilstand, er ventiler styres uafhængigt. Vær omhyggelig med at kontrollere, at den ønskede strømningsbane er konfigureret, især når der skiftes ventiler, inden den indleder buffis flow.
- Nedsænkes teflonrør i Buffere A1, A2, B1 og B2. Sikre passende volumener buffer er tilgængelige for hele protokollen og røret vil fortsætte med at være neddykket. Fremstilling 500 ml Buffere A1, A2 og B2 og 1 liter puffer B1 vil være tilstrækkelig.
- Lod prøven lastning ventil og dynamisk prøvesløjfe som illustreret i figur 2 og ifølge producentens anvisninger. Forbinde prøvesløjfe til prøven ventilindløbet (Position 3) med den mindste længde af slange mulig. Dette vil minimere prøveopløsning i prøven belastning processen.
- Minimere slangelængde mellem prøven, prøveindføringen pumpe, og prøveindføringen ventilindløbet (position 2). Dette vil reducere mængden af prøve nødvendigt at indlæse prøvesløjfen.
- Forberede 8 identisk størrelse par af 1/16 "OD PEEK rør, med hvert par sammen med en 1/4-28 female-to-1/4-28 kvindelig union. Forbindelse parrene til stillingerne 1-8 i to kolonner udvælgelse ventiler. 7 tillidsrepræsentanters tilsluttet in-line til søjle udvælgelse ventilpositioner 2-8 vil senere blive erstattet af de kromatografikolonner, der skal testes. Fagforeningen forbundet inline med Position 1 vil blive opretholdt som en kromatografikolonne bypass.
- Teknisk note: Sørg for hvert par af slangen er forbundet til den samme position på begge kolonner valg ventiler.
- Tænder på både 4-bølgelængde UV / Vis-detektor (QuadTec) lampen og fast bølgelængde 280 nm UV detektor lampe. De bølgelængder, der skal måles ved QuadTec for denne protokol indbefatter 214 nm, 280 nm og 397 nm. Måling 280 nm med både fast bølgelængde UV-detektor og QuadTec giver systemet redundans og sikrer data gyldighed.
- Bekræft alle detektorer er kalibreret i henhold til fabrikantens anvisninger. Den modtryksregulatoren er nødvendigt at reducere luftboblen akkumulering i detektorer og skal installeres nedstrøms af detektorerne, men op-strøm af pH skærmen.
- Systemet præsenteres her omfatter to fraktioneringsn samlere, som giver væsentlig bekvemmelighed for post-run eluat analyse. Sæt fraktion samlere, strøm splitter ventilen, og splitter controller som vist i figur 2. Fraktionsopsamleren forbundet til stilling 1 i fordeleren ventilen indsamle 900 ul eluatfraktioner i 12 ml dyrkningsrør, medens fraktionsopsamleren forbundet til position 2, vil opsamle 100 ul eluatfraktioner i 96 brønds mikrotiterplader.
- Position 2 fraktionsindsamler, splitter ventil, og splitter controller drives offline af kromatografi arbejdsstation. Splitteren styreenhed er indeholdt i en Bio-Rad Econo Gradient Pump, men pumpen komponent af indretningen ikke anvendes. En "% Split" indstillingsmulighed vises på Econo Gradient pumpen, når splitteren ventilen er forbundet til den.
- Set% Split til 10. Position en fraktionsopsamler indsamle 90% af eluatet (900 gl / fraktion) og stilling 2 fraktionsopsamleren indsamler10% (100 gl / fraktion). Brøkdelen samlere vil udvikle sig i takt tillader fraktion antallet af både samlere svare til hinanden.
- Udskift standard fraktionsopsamleren dråbe hovedet på Position 2 fraktionsopsamleren med et mikroplade dråbe hoved. Mikropladen dråbe Hovedet har en mindre åbning, som tillader samling af 50% mindre dråbestørrelser (dvs. 25 ul i stedet for standard 50 ul), og er særlig fordelagtig i forbindelse med indsamling ≤ 500 ul fraktioner.
- Brug af skærmen kontrolpanelet, indstilles Position 2 fraktionsopsamleren at indsamle fraktioner i 96-brønds plader og tid med en hastighed på 1 prøve / minut. Fordeleren controller og position 2 fraktionsopsamler blive startes manuelt umiddelbart efter begyndelsen af den første kromatografi løb.
- Skyl Position 2 fraktionsopsamler og mikrotiterplade drop hoved med buffer B1.
3. Priming System Lines, Programmering Run metode, og EquilibratIng HIC-søjler
- Med systemet Maximizer tilgangsledninger nedsænket i afgasset Buffere A1, A2, B1 og B2, prime arbejdsstationer pumper, skylles prøvesløjfe, og skyl kromatografi systemet ifølge producentens instruktioner. Komplet priming trin med alle 4 maksimering systemet indløb (A1, A2, B1 og B2) for at fjerne resterende luftbobler.
- Fremstilling af systemet kræver manuel betjening af system kontrolenheden via den biologiske software. Bekræft korrekt positionering af prøven ladeventil og kolonner udvælgelse ventiler før start buffer flow.
- Forbered at starte en manuel 1 ml / minut strøm af elueringsbuffer (0% B) gennem systemet, som beskrevet i trin 3,4-3,5.
- I vinduet Opsætning af den biologiske programmet softwaren, skal du vælge "Brug Buffer Blending" og "fosfatbuffer med ammoniumsulfat". Bekræft Buffere A1, A2, B1 og B2 er anført i vinduet Opsætning svarer til dem fremstillet.
- Manuelt indstille strømningshastigheden til 1 ml / minut elueringsbuffer(0% B). Overhold modtryk, ledningsevne, UV-optagelserne, og pH forbliver konsistente og inden for normale grænser. Abnormiteter indikerer luft eller kolonne, blokering, som skal rettes før procedure.
- Skylle alle otte kolonner selektionslinierne med 5 ml elueringspuffer. Gør dette ved først at standse strømmen, sætte begge kolonne udvælgelse ventiler til Position 2, og genoptager 1 ml / minut flow, 0% B. Gentag for kolonne udvælgelse linjer i Positions 3-8.
- Forbinde 1 ml HiTrap HIC-søjler til positioner 2-8 i kolonne udvælgelse ventiler. Komplet trin 3.8-3.13 med en kolonne ad gangen. Vær opmærksom på, hvor HIC kolonne er placeret, hvor udvælgelse ventil position. En sammenfatning af HIC kolonnen medierne egenskaber er anført i tabel 2.
- Den fysiske tilslutning af GE Healthcare HiTrap-kolonner til Bio-Rad DuoFlow kræver en række af fittings anvender 1/4-28, M6, og luer fittings. Fjern union forbinder position 2 søjle valg ventiler. EnCereals Bio-Rad og GE Healthcare fittings, som illustreret i figur 3.
- Sæt opstrøms kolonne fittings til DuoFlow. Undgå at fange luftbobler i kolonnen eller slangen ved fast fastgøre opstrøms kolonne fittings til Udvælgelse ventil montering. Løber elueringsbuffer gennem fittings, indtil al luft udstødes, og en stor dråbe puffer er til stede. Midlertidigt standse puffer flow.
- Fjerne proppen forbundet til søjlen indløbet og placere en stor dråbe buffer med lavt saltindhold (0% B) på toppen af søjlen. Sæt kolonnen til upstream fittings. Med både søjlen indløbet og indløbsfitting fyldt med dråber af puffer sikrer en forbindelse fri for luftbobler.
- Hvis søjlen anvendes første gang, bræk søjlen udløbsenden. Sæt stikkontakten for at de efterfølgende kolonne fittings og udvalg ventil slanger. Kontroller alle fittings stramt spændt.
- Indstil modtryk grænse til 40 psi. Vask kolonnen wed 5 søjlevolumener (5 søjlevolumener = 5 ml) af elueringsbuffer (0% B) med en strømningshastighed på 1 ml / minut. Fortsætter kolonne vask, om nødvendigt, indtil pH har UV kurver og modtryk stabiliseret.
- Vask kolonne med 10 søjlevolumener (10 ml) startpuffer (100% B) med en strømningshastighed på 1 ml / minut. Fortsæt kolonne vask, hvis det er nødvendigt, indtil systemets parametre, der er nævnt i det foregående trin samt ledningsevne har stabiliseret sig.
- HIC kolonne fremstillet ovenfor, er nu klar til prøveindføring. Når alle kolonner, der skal testes, fremstilles, manuelt skifte kolonnens valg ventiler til Position 1 (union) og stoppe buffer flow.
4. Prøveindføringen
- Nedsænkes prøve indløbsrøret i 20 ml prøve for at begynde processen med belastningen prøven i den dynamiske prøvesløjfe. Fra den manuelle indstilling vindue Biologic software skifte prøvesløjfe belastning / vask ventil til Position 1 (prøve), og prøven lastning ventilen til rensning.
- Indled handlingDen prøvesløjfe lastning pumpe opstilling prøven i pumpen røret ved en strømningshastighed på 1 ml / minut, indtil umiddelbart efter prøven når prøvens belastning ventilen. Dette fjerner puffer og / eller luft fra prøven lastelinie.
- Stop strømmen af læsningen pumpen og skifte prøveindføringen ventilen fra Purge til Load. Genstarte prøvesløjfe belastning pumpe ved en strømningshastighed på 1 ml / minut, indtil 10 ml af prøven er blevet trukket ind i den dynamiske prøvesløjfe.
- Tilstrækkelig prøve er nu anbragt i den dynamiske prøvesløjfe op til 10 på hinanden HIC kolonne scouting kørsler.
5. Programmering af software Metode og kørsel af kolonne Spejderbevægelsen protokollen
- Fra Setup vinduet på den biologiske softwaren, skal du vælge systemet enheder markeret med en stjerne i tabel 1.
- Vælg 6 HIC kolonner til analyse. Programmet en lineær faldende saltgradient og 6-søjle scouting fremgangsmåde, som illustreret i tabel 3. Fremgangsmåden programmet er en modification af den biologiske software HIC kolonne setup og er blevet optimeret til den aktuelle applikation.
- En 6-søjle scouting metode anbefales på grund af fraktionsindsamler begrænsninger. Alle 7 kolonner kan spejdet hvis programmet metode tilpasset til at indsamle større fraktion volumener. Tilføj ikke scouting trin, indtil programmet er ellers komplet, som at vælge scouting funktion forhindrer efterfølgende redigering.
- Begynd scouting løb. Manuelt påbegyndes startpuffer (100% B) strømning 1 ml / minut. Tryk på START på splitteren styreenhed til at påbegynde 90% -10% eluat strøm spaltning mellem 12 ml kultur rør fraktionsopsamler (position 1) og 96-brønds plade fraktionsopsamler (position 2) hhv. Teknisk Bemærk: Husk den 96-brønds plade fraktionsindsamler drives offline fra den biologiske softwaren.
- Kører programmet metode. Umiddelbart efter start af programmet metoden løbetur, starter på skærmen kontrolpanel offline 96-brønds plade fraktioneringsn solfanger. Hvis de to fraktion kollektorer ikke 100% synkrone manuelt fremme offline 96-brønds plade fraktionsopsamler de andre fraktionsopsamler forskud til den anden fraktion opsamlingsrør.
- Overhold realtid skærmen for at bekræfte forventede run parametre. Modtryk, ledningsevne, og% B (fig. 4) drives parametre, der kan overvåges for at sikre søjle-til-søjle reproducerbarhed run betingelser. Valve positionering, pH, og prøve belastning bør også overvåges. UV kurver kan sammenlignes for at verificere lignende gennemstrømnings-eluering toppe.
- Anvender in-line og post-run eluatet analyseteknikker til at identificere elueringsprofilen og oprensning af proteinet af interesse (dvs. "målprotein").
- For prøver indeholdende GFP, observere eluering in-line ved hjælp af protein unikke UV-absorbans ved 397 nm. Sammenligne GFP-specifikke 397 nm absorbans sporing den generelle proteinet 280 nm absorbans sporing at estimere relative adskillelseog oprensning ved hjælp af forskellige HIC medier, der spejdet (figur 5).
- Post-run-analyse af GFP og andre målproteiner kan opnås ved flere metoder. Alikvoter på 5-50 pi fra 96-brønds plade fraktioner kan overføres til en frisk plade og analyseres for specifik proteinindhold ved ELISA eller western blot, og totalt proteinindhold i hver fraktion kan analyseres ved anvendelse af konventionel SDS-PAGE eller en Experion mikrofluid elektroforesesystem. GFP-fluorescens kan detekteres i 12 ml dyrkningsrør med UV-lys (figur 6).
- Identifikation af de mest lovende HIC medier kan bestemmes ved sammenligning af GFP eluering forhold til andre proteiner i prøven. Oprensning med de mest lovende HIC medier kan derefter optimeres ifølge andre parametre, herunder typen og koncentrationen af start-buffer og pH.
- Teknisk note: Ved afslutningen af forsøget, placerer alle tilgangsledninger i buffer B1 (afgassesH2O) og skyl de pumper, ventiler og alle rør med vand. Følge producentens anvisninger til rengøring og langtidsopbevaring af kromatografi-system og HIC-søjler.
6. Repræsentative resultater:
Repræsentative HIC saltgradient, ledningsevne og søjletryk på scouting kørsler er vist i figur 4. Ændringen i saltkoncentration (blå linie), som målt ved den procentdel af puffer trækkes fra højsalt-buffer linier er typisk for HIC metode. Som saltkoncentrationen aftager, proteiner bundet til søjlen elueres. Ledningsevne (rød linje), hvilket svarer til observeret saltkoncentration, måles in-line umiddelbart efter de QuadTec og UV-detektorer. Off-set mellem saltgradient og ledningsevne kurver angiver den tid, der kræves for buffer til at rejse fra bufferen indløbet, igennem systemet, og ledningsevnen monitoren. Hele prøven løb, than systemtryk (grå linjer) og pH forbliver relativt konstant.
Figur 5 viser kromatogrammer af sekventielle HIC kolonne scouting kørsler. In-line detektering af totalt protein (A 280, blå linie) og GFP (A 397, grøn linje) udføres ved at måle absorbansen af lys ved 280 nm og 397 nm. Det er muligt at tilnærme den relative GFP overflod og adskillelse for hver spejder løb ved at sammenligne de to linjer. GFP er bundet til de testede HIC-søjler med forskellige varierede grader af affinitet og elueringsprofilen. Udvælgelse af en foretrukken HIC kolonne for fremtidige oprensninger er baseret på identifikation af søjlen, der frembringer den største GFP elueringstop og største adskillelse fra andre proteiner.
I figur 6 blev dyrkningsrør for fraktionerne 10, 12, 14, 16 og 18 i Phenyl FF (høj sub) scouting run visualiseret under omgivende rum (fluorescerende lys) og ultraviolet lys (UV). Glassene blev set både ansigt frem (venstre paneler) og top-down (højre paneler) for at observere den karakteristiske GFP emission spektrum. GFP (grønt) er klart påvist i fraktion 14 i begge UV billeder. Disse post-run data svarer pænt med in-line detektering af GFP ved at måle eluat absorbans ved 397 nm (A 397, grøn linie), som også identificerer Fraktion 14, som indeholder den største toppen af elueret GFP. Den diffuse blå i venstre UV panelet lys udsendt fra UV-lampen.
Figur 1. Skematisk fremstilling af denne protokol. Bakterielt lysat indeholdende proteinet af interesse (GFP, målprotein) er fremstillet, fortyndet i en højsalt-buffer svarende til chromatografi startpuffer og filtreret. Når væskechromatografi systemet er fremstillet, er prøven fyldt og målproteinet er adskilt fra andre proteiner, der er indeholdt in lysatet under anvendelse af en hydrofob kromatografi medium indeholdt i en præpakket HIC kolonne. Separationen Fremgangsmåden gentages adskillige gange under anvendelse af forskellige kromatografimedier (benævnt kolonne spejder) for at bestemme, hvilke medier giver den bedste GFP separation. De eluerede proteiner (eluat) analyseres in-line under anvendelse detektorer, der indgår i den chromatografiske system, og det opsamles i mindre fraktioner med henblik på efterfølgende (post-run) analyse. Baseret på in-line og post-run-analyse af GFP-aktivitet og adskillelse, en optimal HIC kolonne, og chromatografiske medium identificeres.
Tabel 1. Centrale kromatografi systemkomponenter, der anvendes i denne protokol.
Figur 2. Diagram over Bio-Rad DuoFlow medium-tryk-væskekromatografi anvendte system. De vigtigste funktioner i SYstammer omfatter automatiseret puffer blanding, påfyldning af prøven for sekventielle kolonne kørsler, automatiseret udvalg af forskellige kromatografiske søjler, in-line analyse af eluatet, og tandem opsamling af fraktioneret eluatet. Se tekst og tabel 1 for yderligere oplysninger.
Tabel 2. biofysiske karakteristika af HIC testede medier. Navnet på HiTrap HIC kolonnen er indikativ for liganden, liganddensitet og perlestørrelsen.
* FF = hurtig strøm, HP = høj ydeevne. Større perlestørrelse forøger ligandbindingskapacitet og strømningshastighed. Mindre perlestørrelse forøger kromatografisk opløsning. Information afledt fra litteraturen tilvejebragt af fabrikanten.
Figur 3. Tilslutning af GE Healthcare HiTrap HIC kolonnen til Bio-Rad DuoFlow system.To opstrøms 1/4-28 Delrin møtrik ennd ferrule (A1), en han-Luer-til-kvinde 1/4-28 fitting (B1) og mandlige 1/16 "-til-hunluerfitting (C) er tilsluttet. armatur er tillægger HiTrap-søjle efter at være skyllet med puffer og med alle luftbobler fjernes. Søjlen udløb er forbundet til en kvindelig 1/16 "til mand M6 fitting (D), han-Luer-til hun M6 fitting (E), og Luer til kvinde en / 4-28 beslag (B 2). Hele konstruktionen er forbundet til den nedstrøms 1/4-28 Delrin møtrik og rørringen (A 2). Det øverste panel viser fittings adskiltes, og det nederste panel viser de fittings samlet.
| Trin # | Volumen (ml) | Beskrivelse | Parametre | |
| 1 | 0,00 | Indsamle 1,0 ml fraktioner under hele kørslen | ||
| 2 | 0,00 | Schweizch Kolonner | HIC kolonne 1 (Position 2) | |
| 3 | 0,00 | Isokratisk Flow | pH: 6,80 100% B | Volume: 2,00 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 4 | 2,00 | Zero Baseline | QuadTec | |
| 5 | 2,00 | Zero Baseline | UV detektor | |
| 6 | 2,00 | Injicer prøve | Sample Load Dynamisk Loop | Auto indsprøjtes Valve Volume: 0,50 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 7 | 3,00 | Isokratisk Flow | pH: 6,80 100% B | Volume: 5,00 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 8 | 8,00 | Lineær Gradient | pH: 6,80 100% B -> 0% B | Volumen: 10,00 ml Flow: 1,00 ml/ Min |
| 9 | 18,00 | Isokratisk Flow | pH: 6,80 0% B | Volume: 3,00 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 10 | 21,00 | Isokratisk Flow | pH: 6,80 100% B | Volume: 5,00 ml Flow: 1,00 ml / min |
| 11 | 26,00 | Skift Kolonner | EU (Stilling 1) | |
| End | 26,00 | Slutningen af protokol | Automatisk Gentager med 5 ekstra HIC kolonner (Placering 3-7) | |
| Spejder-type | Antal kørsler: 6 | Antallet af trin spejdet: 1 | ||
Tabel 3. Biologic software protokol for HIC scouting anvendt metode.
<img alt = "Figur 4" src = "/ files/ftp_upload/3060/3060fig4.jpg" />
Figur 4 Repræsentative HIC saltgradient, ledningsevne og søjletryk. Som saltkoncentrationen (blå linje) falder, ledningsevne (rød linje) ikke så godt. Off-set mellem saltgradient og ledningsevne kurver angiver tid, der kræves for buffer til at rejse fra bufferen indløbet til ledningsevne monitoren. System tryk (grå linjer) er fortsat relativt konstant for varigheden af kontrolgradienten løb.
Figur 5. Kompilerede kromatogrammer af sekventiel HiTrap HIC kolonne spejder kørsler. In-line detektering af totalt protein (A 280, blå linie) og GFP (A 397, grøn linje) udføres ved at måle absorbansen af lys ved 280 nm og 397 nm. I denne række eksperimenter blev de skarpeste GFP elueringstop observeret med Phenyl FF (høj sub) column. Phenyl FF (høj sub) søjle syntes også at tilvejebringe den størst adskillelse mellem GFP og andre proteiner. Yderligere 1 ml HiTrap HIC-søjler testet indeholdt Phenyl fast flow lav substitution (Phenyl FF (lav sub)), butyl Fast Flow (butyl FF), butyl-S Fast Flow (butyl-S FF) og octyl Fast Flow (octyl FF) .
Figur 6 Repræsentative post-løb visualisering af GFP i prøven eluat. Eluatfraktioner blev opsamlet ved en hastighed på 1/minute, og hver blev analyseret for GFP-indhold. I dette repræsentative figur, var dyrkningsrør for fraktionerne 10, 12, 14, 16 og 18 i Phenyl FF (høj sub) scouting run visualiseret under omgivende rum (fluorescerende) lys og ultraviolet (UV) lys. Glassene blev set både ansigt frem (venstre paneler) og top-down (højre paneler). Den diffuse blå i venstre UV panelet lys udsendt fra UV-lampen. GFP (grøn) er klart påvist i Fraction 14 i begge UV billeder. Det øverste panel viser den totale protein (A280, blå linie) og GFP (A 397, grøn linje) chromatogramprofiler optagelserne af de 5 fraktioner at være visualiseret.
Discussion
Flydende kromatografiske teknikker har vist sig uvurderlig for at forberede højt oprensede proteiner, der er nødvendige for at gennemføre immunologiske 6, biokemiske 7, og strukturelle 8 undersøgelser. HIC oprensningsmetoder oftest kræver empirisk bestemmelse af en foretrukken medium og ligand struktur, liganddensitet og matrix perle egenskaber, er blevet vist at påvirke chromatografiske resultater 2, 3. Automatiseret søjle scouting er en effektiv fremgangsmåde til udvælgelse af en HIC medium til efterfølgende optimering og proteinoprensning 4. Den automatiserede Kolonnen kontrolgradienten præsenteres fremgangsmåde kan let tilpasses til forskellige HIC proteinoprensningsmetoder strategier. Ændringer i saltkoncentration, valg af salt, saltgradient, og pH kan yderligere forbedre oprensningsbetingelser, og virkningerne af at variere disse vigtige parametre er tidligere blevet revideret 13,14. HIC-eluatet, som indeholder en delvist oprenset mål protei kan yderligere oprenses ved anvendelse af en komplementær kromatografisk teknik, såsom ionbytningskromatografi (IEX) eller gelfiltrering / gelpermeationskromatografi 9,10.
På grund af sin unikke lysabsorbans og emissions egenskaber kan elueringsprofilen for GFP identificeres under anvendelse af in-line og post-run fremgangsmåder. Til dette formål kan denne protokol endvidere tilpasses til oprensning af rekombinante GFP-fusionsproteiner, hvori et ubeslægtet målproteinet "mærket" med GFP. GFP-mærkede target-proteiner kan detekteres med UV-lys 11 og oprenset ved hjælp af forskellige kromatografiske metoder, herunder HIC-oprensning er beskrevet ovenfor. GFP rensning er også blevet et pædagogisk dagligt syn i biokemi laboratorier til undervisning i moderne protein naturvidenskabelige metoder 12.
Mens basisk HIC proteinoprensning kan udføres under anvendelse af en væsentligt mindre robust kromatografi systamme, instrumentering præsenteret her har et antal forskellige fordele for at hjælpe til at opnå gunstige resultater. Bemærkelsesværdige fordelene ved at benytte et højt automatiseret system omfatter forbedret løbe-to-run tilstand reproducerbarhed, tidsbesparelser, og faldt muligheder for luft der skal indføres i systemet 10. Systemet kontrolleret puffer blanding, som lettes af systemet Maximizer, giver mulighed for forøget ensartethed i buffer fremstilling og eksperimentel reproducerbarhed. Tegning nok prøve belastning i den dynamiske prøvesløjfe for alle kontrolgradienten løber yderligere at sikre ensartethed af prøven blev tilsat til hver søjle og tillader sekventiel kørsler uden afbrydelse eller manuel ladning. Styret injektion af prøve fra prøven sløjfen på søjlen aftager variabilitet, som kan forekomme med manuel prøveindføringen. Et par søjle udvælgelse ventiler tillader på hinanden følgende prøver kørsler, hver med en anden HIC kolonne, uden at replumb systemet. Udførelse af mul ti-bølgelængde analyse er især fordelagtig, når analyse for et protein med en unik spektrofotometrisk profil. Ud over GFP, kan cytochromer, flavoproteiner og andre hæm-holdige proteiner omfattet af denne teknik. Ledningsevne og pH overvågnings-udstyr mulighed for verificering af real-time eksperimentelle betingelser. Split fraktion eluat samling tillader forbedret fraktion håndtering og muliggør let overførsel til post-run analysemetoder, der kræver et minimalt prøvevolumen (f.eks ELISA, SDS-PAGE, Western blot og Experion mikrofluid elektroforese). Mens driften af anden fraktion solfanger offline kræver manuel synkronisering, det giver mulighed for maksimal fleksibilitet i fraktionsindsamler valg. De væsentligste ulemper ved anvendelse af en sådan robust kromatografi system til HIC kolonne scouting og proteinoprensning omfatter den første tid og budgetudgifter forbundet med instrumentet anskaffelse og operatør uddannelse.
t "> Protokollen præsenteret her anvender en Bio-Rad DuoFlow kromatografi system. kan imidlertid også robust instrumentering fra andre fabrikanter, såsom AKTA Avant fra GE Healthcare, også anvendes og er i stand til at producere tilsvarende resultater Selv sammenlignelige kromatografi-system har unikke egenskaber (f.eks metode programmering, komponent nomenklatur, operatør præference, og skalerbarhed begrænsninger), der bør overvejes, før indlede en rensning procedure eller instrument erhvervelsen.Disclosures
Vælge chromatografireagenser og supplerende instrumentering blev tilvejebragt af Bio-Rad.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health tilskud GM086822 og National Science Foundation større forskningsprojekt instrumentering tilskud DBI-0.960.313. Forfatterne vil gerne takke Drs. Jon Miyake & Donna Hardy (Bio-Rad) og Jennifer Loertscher (Seattle University) for deres tekniske ekspertise. Vælge chromatografireagenser og supplerende instrumentering blev generøst tilvejebragt af Bio-Rad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioLogic DuoFlow Pathfinder 20 System | Bio-Rad | 7602257 | Includes system maximizer, mixer, F10 workstation, AVR7-3 valve, QuadTec UV/Vis detector with flow cell, BioFrac fraction collector, BioLogic software, and starter kit |
| AVR9-8 stream-select valve | Bio-Rad | 7600408 | |
| Diverter valve SV3-2 | Bio-Rad | 7500410 | |
| Stream splitter valve | Bio-Rad | 7410017 | |
| DynaLoop 25 Kit | Bio-Rad | 7500451 | |
| BioFrac Fraction Collector | Bio-Rad | 7410002 | Two fraction collectors used |
| BioFrac microplate drop head adapter | Bio-Rad | 74010088 | |
| BioFrac microtiter plate adapter | Bio-Rad | 7410017 | |
| UV Optics Module | Bio-Rad | 7500202 | |
| Halogen lamp | Bio-Rad | 7601331 | |
| Econo Gradient Pump | Bio-Rad | 7319001 | |
| Experion System | Bio-Rad | 7007001 | |
| Experion Pro260 Analysis Kit | Bio-Rad | 7007102 | |
| HiTrap HIC column selection kit | GE Healthcare | 28-4110-07 | Includes 7 x 1 ml pre-packed columns of HIC media for scouting |
| GE Healthcare-to-Bio-Rad column fittings | GE Healthcare | 18111251 and 18111257 |
References
- Cummins, P. M., O'Connor, B. F. Hydrophobic interaction chromatography. Methods Mol. Biol. 681, 431-437 (2011).
- Nagrath, D., Xia, F., Cramer, S. M. Characterization and modeling of nonlinear hydrophobic interaction chromatographic systems. J. Chromatogr. A. 1218, 1219-1226 (2011).
- To, B. C., Lenhoff, A. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. IV. Protein adsorption capacity and transport in preparative mode. J. Chromatogr. A. 1218, 427-440 (2011).
- Huddleston, J. G., Wang, R., Lyddiatt, A. On the use of mild hydrophobic interaction chromatography for "method scouting" protein purification strategies in aqueous two-phase systems: a study using model proteins. Biotechnol Bioeng. 44, 626-635 (1994).
- Arun, K. H., Kaul, C. L., Ramarao, P. Green fluorescent proteins in receptor research: an emerging tool for drug discovery. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 1-23 (2005).
- Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, L.A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701-e1701 (2010).
- Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone. J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).
- Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAΔ41. J. Vis. Exp. (37), 10-3791 (2010).
- Kong, Y., Li, X., Bai, G., Ma, G., Su, Z. An automatic system for multidimensional integrated protein chromatography. J. Chromatogr. A. 1217, 6898-6904 (2010).
- Camper, D. V., Viola, R. E. Fully automated protein purification. Anal. Biochem. 393, 176-181 (2009).
- Hammon, J., Palanivelu, D. V., Chen, J., Patel, C., Minor, D. L. A green fluorescent protein screen for identification of well-expressed membrane proteins from a cohort of extremophilic organisms. Protein Sci. 18, 121-133 (2009).
- Wu, Y. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochem. Mol. Biol. Educ. 36, 43-54 (2008).
- Queiroz, J. A., Tomaz, C. T., Cabral, J. M. Hydrophobic interaction chromatography of proteins. J. Biotechnol. 87, 143-159 (2001).
- McCue, J. T. Theory and use of hydrophobic interaction chromatography in protein purification applications. Methods Enzymol. 463, 405-414 (2009).
